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如果你已经拥有了一台快速PCR仪，那么你就需要一个快速的酶来与之配对；如果你只有普通的PCR仪，快速的PCR试剂也能让你增速不少。目前已涌现出多种快速的PCR试剂盒，改造手段无外乎以下三种：改造酶、改变buffer的配比或加入添加剂。不过特点各有不同，价格差异更甚。
在PCR反应中，延伸阶段的持续时间主要取决于DNA聚合酶的延伸速率，提高聚合酶的活性，就可以缩短延伸步骤所需的时间，乃至整个PCR 反应所需的时间。PCR反应常用的Taq、Pfu等DNA聚合酶源自天然的生物体中用于DNA损伤的修复以及重组等，要想获得更高延伸活性的热稳定DNA聚合酶，如今已不必像以前那样在各类微生物中苦苦寻觅新欢了，研究者通过基因工程的手段将DNA聚合酶与某种蛋白融合，或直接利用突变的方法筛选出具有高延伸活性的DNA聚合酶。
Stratagene鼎鼎大名的PfuUltra II DNA聚合酶就是将PfuUltra DNA聚合酶融合了专利的ArchaeMaxx PCR增强因子，再加上热启动的抗体。它不仅是市场上保真度最高的聚合酶，延伸速度也相当快，达到15s/kb，相当于其他高保真酶的4倍，能节约70%以上的时间。就以一个2.6 kb的扩增片段为例，PfuUltra II所需时间仅为52分钟，而其他酶约需两个半小时，这就是差距啊。本来高保真Taq酶的特点就是增加了3’-5’的校对功能，提高产物保真度同时要牺牲扩增效率的，作为公认保真度最高的Pfu能达到这样的高效，而一点不牺牲保真度，实在是做克隆的实验人员的”Dream” 酶！扩增40次（50ul体系）的价格是1917元，很贵吧，可以把反应体积缩小到20ul做100次。这只是酶的价格，没办法，一分钱一分货，Stratagen从来都是这么高姿态。（生物通小提示：Stratagen被Agilent收购后，现在国内代理已经是上海吉泰了）
国货当自强。北京的博大泰恒公司最近也推出了用于快速PCR的DNA聚合酶。BioDev Faster Taq是由基因工程技术改造而成的新一代快速Taq酶。由于删除了非必需的蛋白序列，酶结构得到精简和优化，增强了与DNA模板的结合能力，酶分子在模板上的移动速度和聚合dNTP的速度都大幅提高。普通Taq酶的延伸速度一般为1 kb/min，Faster Taq的延伸速度为1 kb/10-15 sec，最快可达1 kb/5 sec，使延伸时间缩短为普通Taq的1/4。Faster Taq的比活性和扩增效率显著高于普通Taq酶，可以缩短变性和退火时间，进一步减少PCR时间。据介绍，Faster Taq扩增3 kb片段仅需38分钟，扩增8 kb片段仅需66分钟。另外，价格也超便宜，100U只需40元，真是抵到你不信。
除了对酶进行改造，PCR反应液也是改造PCR反应效率的重要部分。不信？请看：
QIAGEN的Fast Cycling PCR Kit中也添加了Q-Bond组分，能提高单链Primer和Taq酶之间的亲和性，形成Taq酶-Primer复合物，同时结合到模板上，就这么简单。别小看这一点点进步，足以令引物模板之间的退火时间从常规30秒减少至短短5秒，以每次反应35个循环来计算就可以节省将近15分钟。对于高GC含量或者有复杂二级结构的模板，Fast Cycling PCR Kit里也提供了QIAGEN独门秘器Q-Solution，能非常有效的解开复杂模板的二级结构。这个Q-Solution是无毒的，固定工作浓度无需尝试优化的，这点区别于DMSO。
除了这些添加剂，buffer的配比也很有讲究。QIAGE的反应Buffer中特别均衡了铵离子和钾离子的比例，一方面利用钾离子结合模板和引物上的磷酸基团以中和DNA过量的负电荷，提高模板引物结合力；另一方面利用铵根离子电离氢离子的可逆性竞争，提高特异性结合的引物和模板间的结合力（提供氢离子），削弱非特异结合力（竞争性夺取氢离子），令“强者恒强”，“弱者更弱”，提高退火条件的严谨性，进一步减少反应过程中的非特异扩增，显著提高PCR反应的专一性和灵敏度，同时也使得镁离子浓度变化对反应的影响减少到可以忽略不计。这些都再进一步提高PCR反应速度。价格也不算贵，报价人民币2100元/200个反应，每个反应成本折扣前仅为10元，值得推荐。
此外，PCR反应液中的一些小分子化合物如DMSO、甲酰胺、甜菜碱等也能促进PCR的反应效率。DMSO能改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但是当浓度高时（大于10％）时会降低保真性。甲酰胺则促进某些“引物－模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。硫酸铵能增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。甜菜碱能减低解链温度，并改进长片段PCR的扩增效果。
Epicentre公司的TAQXpedite Fast PCR kit中就含有一个神秘的PCR增强剂，其中含有甜菜碱。这个PCR增强剂能显著改善许多模板的产量和效率，尤其是那些高GC含量或二级结构的模板。有了这个护法，传统PCR也就变成了快速PCR，扩增500bp的片段只需要16分钟。快速PCR在对付复杂模板或超长片段时可能不太灵光，所以这个试剂盒中配了两种master mix，一种用于常规和快速PCR，另一种Difficult/Long Master Mix则用来扩增困难模板或长片段，最长的片段可以达到30 kb。一盒两用，所有PCR都可一网打尽。唯一的缺点就是价格有点小贵，200次（25ul体系）需要2893元。
另外，市场上还有一些热销产品，虽然生物通暂时未能深入探究其原理，但市场反馈也证明了其有效性。比如ABI公司的GeneAmp Fast PCR mastermix，能与9800快速PCR仪和Veriti 96孔PCR仪共同使用，25分钟能完成500bp片段的扩增。它灵敏度颇高，能检测10ng人基因组DNA中的单个基因拷贝，或10个拷贝的HIV靶点。热启动型，且90%以上的产物都加了A尾巴，方便TA克隆。不过扩增片段只能达到2 kb，短了点。250次反应的价格是5270元，有意思的是，还有一个不带说明书的货号，不知能便宜多少。
Takara公司的Z-Taq DNA聚合酶是上市较早的快速酶了，但不知为何现在已经停产，取而代之以新产品SpeedSTAR HS DNA聚合酶。SpeedSTAR的扩增速度为10 s/kb，还是热启动型的，特异性更好，关键是价格也超便宜，250U（50ul体系200次）只需要600元。每次3块钱，不妨一试。
快速PCR固然是好，不过一定要在保证PCR的效果上求快。如果盲目求快，可能会损害了PCR的产量、特异性或保真度。就目前而言，快速PCR还是新生代，评价不够多，产品也不够丰富。随着时间的迁移，快速必将成为PCR的一种趋势。只是在当下，这个螃蟹就看你敢不敢吃了。
如果你既不能买PCR仪，又不愿买快速的酶，却希望PCR做得更快一些，那也不是异想天开。下一篇，就让我们听听专家的建议吧。
（生物通 余亮）
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