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进行受体配体结合检测有同位素方法和非同位素方法。非同位素方法包括时间分辨荧光（TRF）和荧光偏振（FP）等方法，操作简单，对环境无污染，是受体配体结合检测的发展方向。Cisbio的Tag-lite技术将新出现的SNAP-Tag技术和经典的HTRF技术结合起来，稳定可靠，是同位素方法的替代解决方案。
G蛋白偶联受体与配体结合后，受体构象发生改变，7个跨膜区域的相对位置发生改变，将信号传递到胞内，影响细胞功能。受体配体结合是GPCR发挥功能的第一步。
进行受体配体结合检测有同位素方法和非同位素方法。基于滤膜的同位素方法是经典方法，但是它需要洗涤，操作复杂，对环境污染大，越来越多的人在寻求不需要洗涤的更安全的方法。闪烁亲近检测（SPA）是不需要洗涤的同位素方法，它操作简单一些，但是非常昂贵，并且还是基于同位素的检测平台。非同位素方法包括时间分辨荧光（TRF）和荧光偏振（FP）等方法，操作简单，对环境无污染，是受体配体结合检测的发展方向。
所有的实验方法都需要受体和标记配体，并且实验设计相似。在很多情况下，需要使用多种方法来满足下面的实验需求：
• 非特异结合低
• 在标记配体的Kd值范围，特异性结合率 > 80%
• 对于竞争性实验，标记配体的浓度 ≤ Kd
• 加入的标记配体的结合率 < 10%
• 没有受体存在的情况下，标记配体不产生浓度反应
• 实验能达到平衡，信号稳定
• 可重复性高
• 合适及稳定的检测窗口，例如Z’ > 0.5
Cisbio的Tag-lite技术将新出现的SNAP-Tag技术和经典的HTRF技术结合起来，稳定可靠，是同位素方法的替代解决方案。
检测原理
SNAP/CLIP底物与HTRF荧光染料反应形成衍生物，例如与铽穴状化合物（Lumi4®-Tb）形成衍生物，SANP-GPCR或CLIP-GPCR融合蛋白与其反应，形成标记了Tb的GPCR。然后，加入荧光染料标记的配体，Tb与配体上的荧光染料产生能量共振转移，根据信号强弱来检测受体配体结合程度。
实验过程
构建含有标签融合蛋白的Tag-lite 质粒
将pSNAP或pCLIP质粒与目标GPCR的基因序列构建质粒。转染入细胞后，该质粒可表达N端融合了SNAP或CLIP的GPCR，如图1。
图1：构建SNAP-GPCR表达载体
用Tag-lite染料标记GPCR
SNAP和CLIP底物可与HTRF的供体（Donor）Tb穴状化合物结合。底物与SNAP或CLIP反应后，HTRF的供体就与GPCR连接在一起。底物也可与HTRF的荧光受体结合（Acceptor）,形成标记了受体的GPCR，用于其它应用。过程如图2所示。
图2：细胞标记形成GPCR-SNAP-Tb
加入细胞 与Tb-底物衍生物孵育 GPCR-SNAP-Tb形成
受体配体结合
连接了HTRF供体的GPCR与荧光素标记的配体结合（该荧光素是HTRF的受体），产生HTRF信号，即：两个特异性发射光谱，如图3 所示。
图3：受体配体结合实验
GPCR-SNAP-Tb细胞 加入配体 受体配体结合检测
整个过程如图4所示:
图4：Tag-lite受体配体结合实验过程
GPCR-SNAP质粒 GPCR+SNAP融合蛋白 标记了Tb的GPCR GPCR与配体结合，产生HTRF信号
实验材料：
• pSNAP-GPCR质粒: 用来瞬时表达GPCR-SNAP或构建稳转细胞。质粒对GPCR功能没有影响，可在细胞中进行功能性检测。
• Tag-lite SNAP-Lumi4-Tb底物：将HTRF Tb穴状化合物标记到GPCR上。
• Tag-lite 荧光标记配体: 经过验证的与GPCR结合的特异性配体，其上标记HTRF受体染料（红色或绿色）。
应用实例
多巴胺D2受体配体结合实验
进行了配体Kd值检测和受体配体竞争抑制实验，结果如图5、图6所示。
图5：多巴胺D2受体配体Kd测量实验
构建SNAP与多巴胺D2受体的表达载体，瞬时转染后，加入Tb标记的底物，得到GPCR- SNAP-Tb。Tag-lite。然后，加入浓度逐渐升高的红色荧光素标记的配体，检测HTRF信号。本实验所得Kd = 15 ± 8 nM。
图6：多巴胺D2受体配体竞争抑制实验
SNAP-多巴胺D2瞬时转染细胞后，标记Tb。然后，加入3 nM红色荧光素标记的配体和NAPS/PPHT。测定的IC50分别为：0.3 nM和16 nM。
Tag-lite与同位素方法的比较
|
GPCR家族 |
受体 |
化 合 物 |
同位素方法 （Ki nM） |
Tag-lite （Ki nM） |
|
多巴胺 |
D2 |
NAPS（拮抗剂） |
0.64 |
0.14 |
|
PPHT（激动剂） |
13.3 |
7.65 |
Cisbio可提供的产品
• 含有SNAP的质粒：提供含有信号肽的空质粒和转染了受体基因的质粒
• 含有CLIP的质粒：提供含有信号肽的空质粒和转染了受体基因的质粒
• 标记了Tb的底物
• 标记了Acceptor荧光素的配体，荧光素可以发绿光或者红光
• 标记缓冲液
荧光素标记的配体列表如下：
产品货号 标 记 的 配 体 GPCR家族 受体 L0001RED Vasopressin receptors red antagonist #2 - 5,000 tests Vasopressin V2 L0002RED Dopamine D2 receptor red antagonist - 5,000 tests Dopamine D2 L0003RED Vasopressin receptors red antagonist - 5,000 tests Vasopressin V L0004RED VPAC1 receptor red agonist - 5,000 tests Vasoactive Intestinal Peptide VPAC1 VPAC1 L0005RED Opioid receptors red antagonist - 5,000 tests Opioid Delta, Kappa, Mu L0006RED Melanocortin receptors red agonist - 5,000 tests Melanocortin M L0007RED Angiotensin receptors red agonist - 5,000 tests Angiotensin AT1,AT2 L0008RED NK1 receptor red agonist - 5,000 tests Tachykinin NK1 L0009RED NK2 receptor red agonist - 5000 tests Tachykinin NK2 L0010RED Alpha adrenergic receptor red antagonist - 5,000 tests Adrenergic Alpha L0011GRE Beta2 adrenergic receptor green antago - 5000 tests Adrenergic Beta2 L0012RED CXCR4 receptor red agonist - 5,000 tests Chemokine CXCR4 L0013RED CCK receptors red agonist - 5,000 tests Cholecystokinin CCK1,CCK2 L0014RED GABAB receptor red antagonist - 5,000 tests GABA B L0015GRE Histamine H1 receptor green inv ago -5,000 tests Histamine H1 L0016RED Bradykinin B1 receptor red antagonist - 5,000 tests Bradykinin B1 L0017RED Bradykinin B2 receptor red antagonist - 5,000 tests Bradykinin B2 L0018RED GIP receptor red agonist - 5,000 tests Glucagon GIP L0019RED Bombesin receptors red agonist - 5,000 tests Bombesin BB2 L0020RED Ghrelin Ghrelin GHSR L0022RED Endothelin receptors red agonist - 5,000 tests Endothelin ETA, ETB L0024RED Chemokine CCL3 receptors red agonist - 5,000 tests Chemokine CCR1 L0025RED Orexin receptors red agonist - 5,000 tests Orexin OX1, OX2 L0026RED UTR2 receptor red agonist - 5,000 tests Urotensin UTR2 L0027RED PRRP receptor red agonist - 5,000 tests Prolactin-releasing peptide PRRP PRRP L0028RED NMU1 receptor red agonist - 5,000 tests Neuromedin U1 L0030RED GLP1 receptor red agonist - 5,000 tests Glucagon GLP1 L0038RED Bombesin receptors red agonist #2 - 5,000 tests Bombesin BB1, BB3
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