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现在，我们知道，DNA甲基化和组蛋白修饰可调控基因，microRNA和非编码RNA也可以。基因调控的研究工具也越来越多，包括RNA-seq、ChIP-seq、ChIP-chip等。究竟该采用哪种方法来测定miRNA表达，如何确定这些RNA对基因调控的影响呢？
Q3：为了确定表观遗传学因素对基因表达调控的影响，测定DNA甲基化或组蛋白修饰哪个更有用？为什么？
Kun Huang（俄亥俄州立大学）：
对于少量样品，特别是细胞系研究，我倾向于组蛋白修饰，利用ChIP-seq来研究几个关键的标记（如H3K4me2和H3K27me3），因为它们对基因表达的影响更明显。DNA甲基化也为表观遗传学事件提供证据，但具体影响需要进一步的深入分析来发现。对于大量样品，特别是有着数十个甚至数百个样品的临床研究，全基因组范围的DNA甲基化研究（MDBCap-seq）更理想，因成本较低。
Jason Lieb（北卡罗来纳大学教堂山分校）：
这取决于您对“表观遗传”的定义。在我看来，了解组蛋白修饰更有用，因为DNA甲基化与转录之间的关系很复杂。在大部分情况下，组蛋白修饰与转录状态之间的关系更简单。
Xiaole Shirley Liu（Dana-Farber 癌症研究所）：
DNA甲基化和组蛋白修饰都是有用的表观遗传状态测定，每个都有优点和缺点。DNA甲基化是一个更加稳定的标记，可从少量起始材料中产生，这样可用于肿瘤/生物活检的图谱分析。目前有许多不同的DNA甲基化分析方法。不同的研究小组需要根据经费、样品量、覆盖水平（全基因组 vs. 富含CpG的区域）和定量性来选择适合他们需求的方法。组蛋白标记则没那么稳定（特别是乙酰化），需要大量的新鲜细胞来进行全基因组的图谱分析，这对于组织或肿瘤而言比较难。组蛋白的ChIP-seq已经很成熟，提供了出色的数据，成本合理。与DNA甲基化相比，组蛋白可能提供了更多机制上的见解。同时，许多组蛋白有着截然不同的影响，还有许多组蛋白的特征和功能仍知之甚少。目前在分析和了解表观遗传调控上还面临很多挑战，但也创造了令人兴奋的机会。这也是表观遗传学的有趣之处！
Jun Song（加州大学旧金山分校）：
我认为，我们目前并不了解DNA甲基化和组蛋白修饰的全部后果。这些表观遗传标记的基因组位置和确切性质在确定其功能上发挥了重要作用，而我们对于相关生物学规则的认识还很有限。因此，细胞类型特异的DNA甲基化和组蛋白修饰的测定很有用。
Kevin White（芝加哥大学）：
某些组蛋白修饰无疑与基因表达状态有着最高的关联（如转录起始位点的H3K4me3）。在某些情况下，如综合癌症基因组分析，DNA甲基化可协助分辨不同的疾病分子种类，它们对应了转录谱状态。然而，鉴定调控元件的最高效途径是将各种方法结合起来，如DNase超敏性测序、监控组蛋白修饰状态和定位特定的调控元件，如p300或位点特异的转录因子。ENCODE和modENCODE项目在利用这种综合方法定位调控元件方面取得了成功。
Q4：您采用什么方法来解决在ChIP-seq/ChIP-chip数据集中鉴定DNA motif的问题？
Kun Huang（俄亥俄州立大学）：
这是个困难的问题。我们通常采用多种方法，包括将已知motif与区域配对，并利用ChIP-Motif等工具鉴定已知的motif和发现新的motif。
Jason Lieb（北卡罗来纳大学教堂山分校）：
我们一般查看检出峰周围100-200 bp。可靠鉴定motif的重要一步是利用适当的背景序列来进行检测。我们通常利用待测区域周围100-200 bp的DNA序列，这确保了如果您的TF只结合启动子，那么您使用启动子序列作为背景，而不是随机基因组序列，从而降低了假阳性。我们使用多个软件，包括CisFinder、HOMER、MEME和BioProspector。
Xiaole Shirley Liu（Dana-Farber 癌症研究所）：
与从共调控基因的启动子中发现motif相比，从ChIP-chip/seq数据中发现motif更为简单，因数据质量更好。唯一的挑战是数据量大。一些工具非常适合这类分析，包括SeqPos、CisGenome和MEME-chip。
Jun Song（加州大学旧金山分校）：
我尝试汇集尽可能多的信息，以避免假阳性。例如，进化保守性、核小体定位、开放的染色质等，这些都为发现有功能的DNA motif提供了有用的信息。
Kevin White（芝加哥大学）：
发现ChIP-seq数据集中的motif并不是那么困难。我们曾使用多种方法，包括de novo motif鉴定。然而，对于许多不同类的转录因子，由于现有的位置权重矩阵（PWM）的不断增加，对特定数据集中所有的PWM进行打分也许是最快最简单的方法。
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