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转录暂停帮助调整转录本的外观，也影响基因表达。但在大多数情况下，这些暂停并没有与特定的功能相关联。尽管它们在体外被研究，但体内暂停的决定因素以及在整个细菌基因组中的分布仍不清楚。
当年，Matt Larson还是斯坦福大学的一名研究生时，他就对RNA聚合酶的奇怪行为很感兴趣。尽管在细胞中起着关键作用，但RNA聚合酶在产生RNA转录本时停停顿顿，经常休息。“RNA聚合酶的暂停在不同的生物中特别保守，”Larson谈道。“与速度快10倍的DNA复制不同，转录过程经过演化，使得RNA聚合酶暂停识别特定序列，这表明这种暂停在调控基因表达中扮演了关键角色。”
转录暂停帮助调整转录本的外观，也影响基因表达。但在大多数情况下，这些暂停并没有与特定的功能相关联。尽管它们在体外被研究，但体内暂停的决定因素以及在整个细菌基因组中的分布仍不清楚。
Larson已经利用单分子光学捕获技术来研究大肠杆菌RNA聚合酶的转录暂停，但他希望将这些数据与高分辨率的RNA聚合酶动力学视图相比较，以确定这些暂停是否在调控基因表达中发挥了明显作用。为了实现这一点，他与威斯康辛大学的Robert Landick合作，转向一种称为NET-seq（native elongating transcript sequencing）的方法1。大约在同一时间，另一个独立的研究小组，罗格斯大学的Richard Ebright和Bryce Nickels，也开始了类似的研究。
暂停普遍存在
基于RNA聚合酶高度密集的DNA位点表示停顿的前提，NET-seq以单核苷酸分辨率定位RNA聚合酶的占有水平，从而鉴定暂停位点。
“与NET-seq最接近的技术是RNA-seq，它将所有RNA从细胞中分离出来，以确定哪些基因活跃表达。这包括成熟的转录本以及仍在被合成的转录本，”Larson解释道。“对于NET-seq，只有正在被合成的转录本被分离出来，让我们能了解那些可能被错过的不稳定转录本。”
Larson及其合作者利用NET-seq，鉴定出大肠杆菌中16个核苷酸的共有暂停序列，以及大约2万个新发现的暂停位点，表示平均每100 bp中就存在一个暂停位点2。“我们惊讶地看到，这个基本的序列特异性相互作用导致了整个基因组的普遍暂停。在研究任何一组特定基因或通路时，这些新发现的暂停位置无疑将成为其他科学家的资源，”Larson说。
Landick补充道：“这些结果将为了解转录调控机制提供新的见解。它们也将对合成生物学有重要意义，基因设计者可能希望避免暂停序列，或将它们放在特定位置，以影响基因表达。”
协调和保守
Larson及其合作者发现，RNA聚合酶倾向于在所表达基因的前100个核苷酸内暂停，这有可能限制其他RNA的合成，直至核糖体可以开始翻译。此外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的翻译起始位点都充满了共有序列。这一发现“完全出乎意料，也表明[暂停位点]发挥着重要的调控作用，”Larson谈道。
据Roberts介绍，一个可能的调控机制在于核糖体结合序列的接近。“由于核糖体结合位点在物理上被暂停的RNA所遮蔽，一旦RNA聚合酶停留在暂停位点，暂停可能实现了准备RNA进行翻译的某些过程。”
研究人员发现，共有序列导致不同谱系的RNA聚合酶暂停，甚至是哺乳动物RNA聚合酶II。这表明，共有序列暂停可能在原始生物的早期进化，随后被指派来控制各种调控背景下的转录，这也解释了如今观察到的转录暂停的多种功能。
有趣的相互作用
在一项独立研究中，Ebright、Nickels及其同事利用NET-seq来定义大肠杆菌中暂停的关键序列决定因素3。研究人员鉴定出15,000多个暂停位点，并通过比对这些序列，他们鉴定出明确的暂停诱导序列元件。
Ebright及其团队之前已经表明，RNA聚合酶与核心识别元件（CRE）存在相互作用，而且这种相互作用对转录起始很重要。为了探索这种相互作用在暂停中的作用，Ebright和Nickels构建了一种突变的RNA聚合酶，它在识别CRE上有缺陷，并开发出NET-seq的一个变种，称为merodiploid NET-seq（mNET-seq），这实现了突变RNA聚合酶的分析。
令他们吃惊的是，破坏RNA聚合酶和CRE之间相互作用的一个替换增加了体内和体外的暂停。“当我们开始工作时，我们预计RNA聚合酶与CRE之间的相互作用导致暂停。这些数据让我们的想法有了180度的转变，”Ebright说。
Ebright的研究小组接着确定RNA聚合酶与CRE之间的序列特异性相互作用通过哪种机制抵消暂停，表明这些相互作用的主要功能可能是抑制转录暂停过程中的噪音。
展望未来，研究人员将继续扩大RNA聚合酶突变体的工具箱，以检验RNA聚合酶与CRE之间相互作用在其他关键的转录过程中的作用，他们将分析真核生物RNA聚合酶II的序列依赖性暂停。他们也想鉴定其他的DNA序列或RNA聚合酶与DNA之间的其他相互作用，可能影响这些位点的暂停。
但就目前而言，这一领域仍被一个关键问题所困扰，那就是：“整个基因组中有数千个暂停位点，它们的功能作用是什么，如果有的话？”
（作者：Janelle Weaver博士/生物通编译）
参考文献
1. Churchman LS, Weissman JS. 2011. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature 469(7330):368-73. doi: 10.1038/nature09652.
2. Larson MH, Mooney RA, Peters JM, Windgassen T, Nayak D, Gross CA, Block SM, Greenleaf WJ, Landick R, Weissman JS. 2014. A pause sequence enriched at translation start sites drives transcription dynamics in vivo. Science 344(6187):1042-7. doi: 10.1126/science.1251871. Epub 2014 May 1.
3. Vvedenskaya IO, Vahedian-Movahed H, Bird JG, Knoblauch JG, Goldman SR, Zhang Y, Ebright RH, Nickels BE. 2014. Interactions between RNA polymerase and the "core recognition element" counteract pausing. Science 344(6189):1285-9. doi: 10.1126/science.1253458.
4. Roberts JW. 2014. Molecular basis of transcription pausing. Science 344(6189):1226-7. doi: 10.1126/science.1255712.
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