炎症性Caspase为细菌内毒素(LPS)的胞内天然免疫受体

   Lipopolysaccharide (LPS，脂多糖)，俗称为内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。LPS也是病原菌最为重要的模式分子，可诱导严重免疫反应，是败血症和内毒素性休克最主要的诱因。机体天然免疫的核心是识别病原模式分子的模式识别受体(PRR)，PRR蛋白中最为人们熟知的就是定位于膜上Toll样受体家族。Bruce Beutler、Ruslan Medzhitov和Charles Janeway等人于上世纪90年代鉴定出Toll样受体4(TLR4）为LPS的膜上受体，LPS结合TLR4后诱导细胞因子和炎症因子转录。

   最近在小鼠巨噬细胞中的研究表明进入胞内的LPS可诱导非经典炎症小体通路(inflammasome)的激活，导致细胞炎症性坏死，在小鼠内毒素性休克模型中起关键作用。但胞内LPS如何被识别进而诱导炎症性坏死的机制以及人的细胞是否也存在胞内LPS感知通路则完全不清楚。

    邵峰实验室近年来一直专注于研究宿主细胞质中感知细菌和病原细菌的分子免疫机制。在2011年的一项研究中，他们首次鉴定出NAIP家族的PRR蛋白不仅可以作为受体直接识别细菌鞭毛素蛋白，也可以识别存在于一大类致病菌中的毒力因子分泌系统的组成蛋白(Zhao et al., Nature 2011)。

    在今年上半年的研究中，邵峰团队还发现Pyrin蛋白（遗传突变导致家族性地中海热自炎症疾病）作为PRR蛋白感受多种不同病原菌和毒素对宿主Rho家族小G蛋白的修饰和失活，进而介导巨噬细胞炎症小体复合物的组装和下游炎性蛋白酶caspase-1的激活，启动抗细菌炎症反应（Xu et al., Nature 2014）。

    在这项最新的研究中，他们发现人和小鼠的炎症性Caspase-4/5/11为胞内LPS的受体，直接结合LPS发生寡聚化而被激活，导致细胞炎症性坏死。报道该发现的论文” Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS”于2014年8月6日在《Nature》杂志以Article形式在线发表。

    在该项研究中，邵峰实验室的研究人员首先建立了一个可以将LPS高效导入哺乳动物细胞内的转染方法，使得LPS诱导细胞坏死由此前报道的20~30%提升到95%左右，利用这个强大和稳定的实验体系，他们首先发现人源的单细胞对胞内LPS诱导细胞坏死敏感，该过程由Caspase-4蛋白所介导。

   Caspase-4以及Caspase-5为小鼠非经典炎症小体通路中Caspase-11在人细胞中的同源蛋白，都属于炎症性Caspase家族。他们同时也发现，和小鼠Caspase-11只在巨噬细胞中表达不一样，Caspase-4表达并不局限于巨噬细胞和单细胞，在一些人的上皮细胞和角质细胞中也有很高的表达，并且这些非免疫细胞也能通过Caspase-4响应胞内LPS，发生严重的细胞坏死。另外，他们的研究也表明Caspase-5和Caspase-4功能类似。

    为进一步研究Caspase-4/11响应胞内LPS的激活机制，邵峰团队的研究人员在大肠杆菌和昆虫细胞两个体系中表达和纯化了Caspase-4/11。在鉴定重组表达的Caspase-4/11蛋白的过程中，他们发现，大肠杆菌来源的蛋白以高聚合状态存在，而昆虫体系表达的蛋白则为均一的单体，并且昆虫表达的Caspase-4/11在和细菌的裂解物孵育后也会发生聚合。

    以这个意外的现象为线索，他们进而通过一系列的生化实验，发现并证明LPS可以直接结合Caspase-4/11，并诱导其发生寡聚化，寡聚后的Caspase-4/11则显示出明显的蛋白酶活性，导致细胞炎症性坏死。Caspase-5和Caspase-4/11一样，也能够直接结合LPS，发挥受体的功能。

    Caspase-4/5/11 和细胞凋亡中initiator caspase(Caspase-8/9)以及经典炎症炎症小体通路中的Caspase-1类似，他们的N端都由CARD或类似的死亡结构域组成。因此，研究者一般认为Caspase-4/5/11的激活和Caspase-1/8/9类似，由上游的一个包含CARD或死亡结构域的蛋白通过蛋白相互作用诱导寡聚而激活，如Caspase-9由Apaf-1激活，Caspase-1由NOD样受体激活 。

    邵峰团队在进一步深入研究后发现，Caspase-4/5/11这类炎症性Caspase的CARD结构域非常特别，可以直接结合LPS，并发生寡聚化。他们还在该结构域中找到了可能结合LPS的残基位点，这些位点突变体不仅丧失结合LPS的能力，同时也失去介导LPS诱导细胞坏死的功能。因此，这项研究不仅鉴定了胞内LPS的受体蛋白，使得开发败血症药物成为可能，同时也对我们理解Caspase家族蛋白的激活机制有很大的概念突破。 

    NIBS首届PTN项目的博士生石建金和邵峰实验室室的博士后赵越为本文共同第一作者，NIBS与中国农业大学联合培养博士生王宇鹏也对本工作有重要贡献。本文其它作者包括北京生命科学研究所博士生高文清和李鹏，来自生物物理所的访问学者丁璟珒博士以及邵峰实验室的技术员胡丽燕。邵峰博士为本文通讯作者，该研究由科技部973项目，北京市政府，国家自然科学基金委员会，中科院先导计划以及美国HHMI资助，在北京生命科学研究所完成。

原文摘要：

Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS

The murine caspase-11 non-canonical inflammasome responds to various bacterial infections. Caspase-11 activation-induced pyroptosis, in response to cytoplasmic lipopolysaccharide (LPS), is critical for endotoxic shock in mice. The mechanism underlying cytosolic LPS sensing and the responsible pattern recognition receptor are unknown. Here we show that human monocytes, epithelial cells and keratinocytes undergo necrosis upon cytoplasmic delivery of LPS. LPS-induced cytotoxicity was mediated by human caspase-4 that could functionally complement murine caspase-11. Human caspase-4 and the mouse homologue caspase-11 (hereafter referred to as caspase-4/11) and also human caspase-5, directly bound to LPS and lipid A with high specificity and affinity. LPS associated with endogenous caspase-11 in pyroptotic cells. Insect-cell purified caspase-4/11 underwent oligomerization upon LPS binding, resulting in activation of the caspases. Underacylated lipid IVa and lipopolysaccharide from Rhodobacter sphaeroides (LPS-RS) could bind to caspase-4/11 but failed to induce their oligomerization and activation. LPS binding was mediated by the CARD domain of the caspase. Binding-deficient CARD-domain point mutants did not respond to LPS with oligomerization or activation and failed to induce pyroptosis upon LPS electroporation or bacterial infections. The function of caspase-4/5/11 represents a new mode of pattern recognition in immunity and also an unprecedented means of caspase activation.