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细胞培养在现代传染病研究中占据了关键的地位，尤其对于病毒本身研究和病毒基因表达产物研究，为此这里通过了解几位病毒学家的培养思路和技巧，介绍了一些病毒-细胞培养系统和方法。
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生物通报道：病毒会感染几乎每一种生物机体，无论是人、老鼠、跳蚤还是细菌，都逃脱不了病毒的攻击。但是这些寄生生物无法独立生活：它们需要进入宿主细胞内部，这也就是为什么病毒学家也需要培养细胞，不过要想掌握这种细胞培养技术，就必须对病毒和宿主细胞都有所了解。
因为这个过程并不是简单的把病毒和细胞放到培养皿中就行，来自麦克马斯特大学的Charu Kaushic教授指出。在其博士后阶段，Kaushic教授就通过来自女性生殖道的上皮细胞分析了先天免疫系统，之后她开始构建自己的实验室，致力于研究性传播HIV艾滋病病毒，和单纯疱疹病毒2型如何与相同细胞类型相互作用的。为此她建立了细胞培养体系，花费多年分析培养的系数，比如细胞的特性，不同剂量的病毒，生产率等等。最终结果公布在Methods杂志上（Methods, 55:114-21, 2011）。
美国国立卫生研究院国家过敏症和传染病研究院的副主任Marshall Bloom表示，病毒学家需要掌握细胞培养的知识，存在几方面的原因：临床病毒学家可能需要将病人的样品加入到细胞中，寻找感染的证据，这是其一，其二研究人员也需要利用细胞作为生物学实验容器来分析细菌，另外利用病毒感染细胞，或者表达特定的病毒蛋白，也能发现病毒的行为特征和宿主应答的方式。
“细胞培养在现代传染病研究中占据了关键的地位，尤其对于病毒本身研究和病毒基因表达产物研究，”Bloom说。
为此这里通过了解几位病毒学家的培养思路和技巧，介绍了一些病毒-细胞培养系统和方法。
如何选择细胞
选择哪种细胞取决于病毒，不过要找到正确的病毒宿主可能还要玩一下“侦探游戏”，最明显的首选场所就是作为病毒天然宿主的动物或者组织中的细胞，比如骆驼细胞就是中东呼吸综合征寻找宿主细胞的第一选择。
但想到并不一定就能做到，美国国立卫生研究院国家过敏症和传染病研究院的副主任Marshall Bloom在开始研究阿留申水貂病（Aleutian mink disease）病毒的时候，他曾试过水貂细胞，以及每一种他能买到的哺乳动物细胞系，但唯一能发生感染的是猫肾细胞 (J Virol，73:3835-42，1999 年)。
如果一种病毒被证明十分挑剔，那么就可以多准备一些细胞系，如HeLa细胞系，这种细胞系能作为多种病毒的宿主，Bloom说，此外幼仓鼠肾 (BHK，Baby hamster kidney) 细胞和来自鸡胚胎的成纤维细胞也值得试试，来自佛罗里达大学的名誉教授Richard Condit建议道。
除了细胞类型，病毒学家还必须做出另一个选择，那就是选择直接从生物机体中培养的原代细胞，还是经过多年培养，传代多次的永生细胞系。两者都有利有弊。
永生细胞系，譬如HeLa的优点就是方便，易于生长，可重复性高。来自洛克菲勒大学丙肝研究中心的博士后研究员Mohsan Saeed指出，大多数病毒研究采用的就是这种细胞系。
但是这种细胞大多只能将其相似之处传递给生物机体中的另一细胞，它们不断分裂，改变了它们的新陈代谢，而且也经常发生去分化，重新回归到了原始状态。最关键的是，对于病毒学家来说，这些细胞系只是表现出异常的免疫应答活动，而不是像体内细胞那样对病毒产生防御力，因此从这些细胞系中得到的结果可能就是不确定的，或者错误的。
因此Saeed认为，如果可能的话还是用原代细胞。原代细胞看起来更像体内细胞，反应也更像体内细胞，但是这些细胞会出现并发症，它们需要特殊的培养技巧，而且最终还是会死亡。
如果一个实验室希望用的是人体原代细胞，那么这又要增加一层难度了。一般来说这些细胞内容可以通过商业化产品获得，如Lonza就要卖21种人体原代细胞，包括肝细胞 (300-600万细胞安瓿约为500 美元，注：美国当地价格)。
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然而，有时研究人员需要的组织类型并没有哪家公司有卖，或者希望选择特殊的细胞来源，那么他们就不得不去寻找医院细胞来源了。
与克隆系的统一细胞不同，捐赠组织会随着个体差异而发生变化，这可以是益处，也可以是坏处。一些研究人员希望了解病毒如何感染个体病患的，但是一般分子病毒学家还是希望重现性较好，但使用不同批次原代培养细胞，会增加重现性难度。
病毒
细胞当然只是培养体系的一半，另一半病毒也存在选择上的问题。一旦病毒开始在培养基中生长，那么它们就会发生改变，为了适应生长速度或毒力而产生突变。Bloom在研究中就发现猫肾培养基中的阿留申病毒会导致水貂患上一种轻微的疾病，至今他们也不清楚原因是什么。
病毒来源的选择主要看个人的目的，如果你希望感染培养基中的每一个单细胞，分析细胞的反应，那么可以选择高感染性的实验室毒株，但是如果要分析潜在治疗的效果，那么建议选择野生型病毒。
在选好细胞系和病毒毒株后，研究人员就要开始考虑所用病毒的剂量，以及感染的时长。
“这并不是最令人感兴趣的实验，但确实实实在在的科研，”Kaushic说。定量病毒感染培养基所需份量，以及计算空斑或蚀斑数量最经典的方法就是在培养皿或培养瓶中的单层细胞实验，每个蚀斑都是单个病毒粒子感染的应答。
研究人员可以利用手头上的数据获得他们想要的感染复数（multiplicity of infection，MOI），即感染实验中病毒-细胞的比率。如果MOI为1，就是每个细胞对应一个病毒，那么只需要感染三分之二的细胞。因为病毒是随机扩散，一些细胞没有碰到病毒感染，而旁边的细胞却有两到三个粒子感染。
为了能均一一对一感染每个细胞，Saeed建议采用MOI为5，如果要分析病毒在细胞间的传播，那么他建议MOI为0.01，这样100个细胞中最开始只有1个被感染，之后再传播到旁边细胞。
此外，研究人员还需监控感染过程，最明显的变化就是致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，大多数的培养细胞能以平铺单层细胞生长，但被感染的细胞也许会出现聚合，或者破裂。“细胞看上去状态并不好，但仍然存活着，并且繁殖病毒，”Fields Virology操作指南作者Condit说。
不过并不是所有的感染都会导致CPE的出现，因此研究人员可能需要采用其它方法，对于培养皿或孔，研究人员可以采用PCR来识别病毒基因，或者Western blotting来检测病毒蛋白。
Kaushic 警告说，找到病毒核酸或蛋白并不一定就确认了病毒的感染和复制能力，比如说，许多HIV研究者会检测核心病毒蛋白p24是否存在，如果一不小心，他们也许识别的就是原初接种的不完整，非活性病毒粒子中的p24。
Kaushic多方面评估病毒的复制力，比如他们实验室就会增加一个HIV指示细胞系，这些细胞来自HeLa细胞系，能表达HIV受体，以及受HIV序列调控的β-半乳糖苷酶基因，如果这些细胞接触到活着的HIV，就会在X-Gal中呈现出蓝色来。
目前美国NIH的艾滋病试剂部门免费给非商业机构提供这种“TZM-bl”指示细胞，如果需要购买，可以从ATCC购买（当地价格为200美元）。
此外，还有一些工具能帮助研究人员识别被感染的单个细胞，这包括活细胞病毒基因原位荧光杂交，以及固定细胞蛋白免疫荧光等。
一些实验室会将荧光蛋白基因插入到病毒基因组中，这样培养基中感染细胞就会发光，但是这些额外插入的基因也许会减慢病毒生命周期，Saeed说。而且增加的核酸也会改变RNA的二级结构，影响翻译的速度，从而造成细胞无法高效的完成病毒粒子基因组复制。
另一个选择可以考虑改变细胞，这样就能在出现变化的时候进行指示。洛克菲勒实验室曾构建了一个人肝癌细胞：HuH 7.5，这种细胞被丙肝病毒感染，病毒蛋白酶能裂解一种成为MAVS的细胞内蛋白，后者一般锚定在线粒体外膜上。研究人员设计了一个嵌合基因，将MAVS裂解位点，线粒体靶向序列，与红/绿荧光蛋白连接到一个核定位序列上。
在未感染细胞中，生成的蛋白栓在线粒体上，当病毒进入细胞，蛋白酶就会切断受体蛋白，核定位序列就会带着这些序列进入细胞核，这样研究人员就能很方便的识别出感染细胞与未感染细胞。
。在未受感染的细胞，由此产生的蛋白质仍然拴线粒体。当病毒进入细胞时，蛋白酶劈开记者蛋白，和核定位序列接管。研究人员可以很容易区分点燃核从感染细胞发光原子核与未感染的细胞。(Real-time imaging of hepatitis C virus infection using a fluorescent cell-based reporter system，Nat Biotechnol, 28:167-71, 2010)
组织工程
有些时候可能细胞与病毒的简单选择并不能满足模型感染的需要，“对于某些病毒来说，培养过程的生态环境也很重要，”Ramanan 说。例如，肝炎病毒不会只感染体内肝细胞，肝脏中还有血管内皮细胞、免疫细胞和其他细胞类型，即使这些细胞都不被感染，但是还是会影响病毒的感染过程。
来自麻省理工学院实验室的研究人员研发了一种微模式肝细胞培养系统，这一系统采用模具将胶原点打入每个培养孔的底部，然后培养人原代肝细胞，这些细胞会选择性的粘附到胶原上，周围是小鼠胚胎成纤维细胞。活细胞在培养基中能维持其极性，并存活数周，这比一般细胞培养的几天时间要长，因为能用于支持乙肝病毒和丙肝病毒的生命周期。（Persistent hepatitis C virus infection in microscale primary human hepatocyte cultures，PNAS, 107:3141-45, 2010）
另一种方式，就是让培养基更接近于三维基质细胞生长环境中的组织细胞，举例来说，研究人员可以在一个胶基质中组合不同的细胞类型，构建一个三维“类器官”。但是对于病毒学家来说，这种方法存在一个缺点——由于所使用的基质，病毒也许无法遍及整个区域，而且也很难判断病毒粒子是否能接触到类器官内部的细胞。“这不如单层细胞那么好控制，”Saeed说。
病毒组织工程学还尚处于起步阶段，存在不少问题，而这些问题在单层细胞培养中可能更容易解决。Ramanan说，“提出的问题也许与解答问题同样复杂。”
（生物通：张迪）
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