实验设计 | Drop-off数字PCR方法之二：基因突变和基因缺失计算方法

如何用Crystal Miner分析软件对Drop-off数字PCR结果进行分析，详见下文。

如何用Crystal Miner分析软件对Drop-off数字PCR结果进行分析

可以仅使用Crystal数字PCR的其中两个通道高灵敏性的对突变等位基因（MAF）进行绝对定量。

第一个通道：Drop-Off探针仅和野生型序列互补，而跳过突变序列。（图1，纵坐标的蓝色通道）

第二个通道：参考探针与突变位点的相邻位点进行杂交并且与突变和野生型等位基因进行互补（图1中横轴的绿色通道）

当存在野生型等位基因的时候，drop-off以及参考探针都会和模板进行杂交，进而出现双阳的微滴。（即图1中绿松石颜色的微滴）

当存在突变等位基因的情况下，即使是单个核苷酸的突变也足以破坏drop-off探针杂交的不稳定性，因此只有参考探针可以和模板进行杂交，进而产生单阳点。（即图1中绿色微滴）。

想了解更多Drop-off设计，分析的信息，请详细参阅我们的说明书“Drop-off Crystal Digital PCR检测NRAS，KRAS和EGFR突变”，网址，https://www.stillatechnologies.com/application-notes/

图1

A. Crystal miner 2维图可以显示drop-off三个通道的结果，双阳性点（绿松石颜色）含有野生型等位基因，单阳性点（绿色）包含突变等位基因，以及双阴性点（黑色）。

B. 在微滴生成过程中，只有一小部分的突变型等位基因和野生型等位基因可以随机分配到一个微滴中，进而显示为双阳点（绿松石颜色），尽管双阳的微滴数不能确定，但是其比例也是非双阳的微滴数，即绿色和黑色。

使用Crystal Miner分析软件一步一步的方法对Drop-off结果进行定量分析

野生型浓度Cwt（双阳性微滴），可以直接通过Pwt的比例计算得到（不管第三通道是阳性还是阴性），drop-off突变的浓度Cmut（突变等位基因），可以通过Pmut计算得到。由于野生型和突变等位基因是共存状态，所以阳性微滴可以用来分辨那些模棱两可的情况。例如，Pmut可以通过除去双阳的微滴计算得到，因而可以将突变阳性微滴从可以和参考探针结合而不能和Drop-off探针结合的群体中排除掉（不管第三通道是阳性还是阴性）。

使用Crystal Miner 分析软件进行量化计算，需要按照以下步骤：

1. 对三种微滴群体进行命名，突变型阳性，突变型阴性，野生型阳性。

按照步骤，ANALYZE DATA> Plots＆Populations> 2D点图。
选择 “多边形”类型作为阈值模式，之后选择您感兴趣的孔（wells）。
2D图中，纵坐标是Drop-off探针检测通道，横坐标是参考探针检测通道。双击轴可进行通道属性的修改，或者圈出这三个微滴群中您感兴趣的群。
按Ctrl和右键可以进行圈群，松开Ctrl，再次点击右键即完成圈群功能。可以对其进行命名，并选择一个颜色来区分。

2. 区别阴性群体和突变阳性群体：

步骤：ANALYZE DATA> Plots＆Populations> Population Editor
在右侧的“population”界面下，选择突变阴性群体，之后点击“编辑”，点开选择项，选择“need to define specific negative ”之后点击“编辑阴性”。
在Zones list窗口下，点击突变阴性群体对应的框“阴性”。
点击应用即可。

3. 计算MAF的drop-off突变。
4. 在View results-result table 界面下得到drop-off突变的浓度Cmut，以及野生型浓度Cwt，由Miner软件自动计算得到。
5. Export，导出所有数据。
6. 计算MAF drop-off突变，即MAF drop off =Cmut/（Cwt+Cmut）

提示：

与drop-off突变体相对的LOD值随着预期的野生型浓度呈指数增加的趋势（在95%置信水平下，LOD从0.2增加到0.27cp/ul）
如果不排除双阳的点而将其归为阴性微滴中，则MAF的Drop-off突变则会低估25%。

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