新型生物标志物pyroGluGly、Phe与PheTrp在混合/胆汁淤积性药物性肝损伤（DILI）中的鉴定与特征分析及其临床鉴别价值

本刊推荐：本研究通过代谢组学技术鉴定出吡咯谷氨酰甘氨酸（pyroGluGly）、苯丙氨酸（Phe）和苯丙氨酰色氨酸（PheTrp）作为混合/胆汁淤积性药物性肝损伤（DILI）的新型生物标志物。这些标志物在区分急性DILI与恢复期患者及其他肝病（除梗阻性黄疸外）方面表现出卓越的鉴别能力（ROC曲线下面积>0.9），尤其pyroGluGly在碱性磷酸酶（ALP）升高患者中仍保持高区分度，为DILI的临床诊断与鉴别提供了新工具。

引言

药物性肝损伤（DILI）是因药物使用导致的肝脏损害，占急性肝衰竭病例的10%以上。根据组织损伤部位，DILI分为肝细胞型、混合型和胆汁淤积型，其诊断依赖于丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）等血清标志物。然而，现有标志物如ALT、AST、ALP、总胆红素（T-Bil）和γ-谷氨酰转移酶（GGT）在多种肝病中均有异常，特异性不足，难以准确诊断DILI。因此，探索新型生物标志物成为改善DILI诊断的关键。代谢组学通过分析生物体液中的代谢物谱，为发现肝病相关标志物提供了新途径。既往研究已涉及肝癌（HCC）、肝硬化等疾病的代谢物标志物，但针对DILI的特定标志物且经过定量验证的研究仍较少。本研究旨在通过代谢组学筛选并验证可用于混合/胆汁淤积性DILI诊断的新型生物标志物。

方法

研究对象

研究招募了52例DILI患者、486例其他肝病患者和60名健康参与者。DILI患者来自日本多家医院，包括肝细胞型（40例）、混合型（13例）和胆汁淤积型（13例）。DILI诊断依据CIOMS/RUCAM和DDW-J 2004评分标准，且ALT≥150 U/L或ALP≥2倍正常值上限。其他肝病包括病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝损伤、代谢相关脂肪性肝病/代谢相关脂肪性肝炎（MASLD/MASH）、原发性胆汁性胆管炎（PBC）、梗阻性黄疸（OJ）、肝硬化和HCC。健康参与者为无吸烟史、未服药的志愿者。

样本收集与处理

采集新鲜血液样本，室温静置1小时后离心（1300×g，10分钟），分离血清并于4小时内分装，-80°C保存直至分析。

代谢组学分析

使用液相色谱-质谱（LC-MS）技术对DILI患者和健康参与者血清进行非靶向代谢组学分析，检测725种代谢物离子。数据通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）处理，结合错误发现率（FDR）和效应大小（Hedges' g）筛选候选标志物。候选代谢物通过标准品验证其结构和保留时间。

验证性生物标志物检测

针对筛选出的候选标志物，建立并验证定量检测方法，使用LC-MS/MS技术测定血清中吡咯谷氨酰甘氨酸（pyroGluGly）、苯丙氨酸（Phe）和苯丙氨酰色氨酸（PheTrp）的浓度。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估其鉴别能力，并采用多元逻辑回归分析考察其与患者临床特征的相关性。

结果

研究对象特征

DILI患者中位年龄65岁，男女比例37:29，体质指数（BMI）中位值22.59 kg/m²。肝细胞型DILI患者ALT水平较高（中位480 U/L），而混合型和胆汁淤积型DILI患者ALP水平显著升高（中位601 U/L和1289 U/L）。其他肝病患者组在性别、年龄和BMI上与混合/胆汁淤积型DILI组存在一定差异，如自身免疫性肝炎和PBC患者以女性为主。

代谢组学筛选候选标志物

PCA分析显示，健康参与者、DILI恢复期和急性期患者的代谢物谱存在明显分离，急性期患者分布于右上区域。PLS-DA进一步表明，混合型和胆汁淤积型DILI在急性期具有相似的代谢物谱，与肝细胞型DILI区分开。通过FDR和效应大小分析，从混合/胆汁淤积型DILI中筛选出13个共同候选代谢物离子，最终鉴定出pyroGluGly、Phe和PheTrp作为候选标志物。这些代谢物在急性期DILI患者血清中水平显著高于恢复期和健康对照组。

定量验证与特征分析

定量检测显示，pyroGluGly、Phe和PheTrp在混合/胆汁淤积型DILI急性期血清中浓度显著变化（pyroGluGly和Phe升高，PheTrp降低）。ROC曲线分析表明，三者区分急性期与恢复期混合/胆汁淤积型DILI的曲线下面积（AUC）均>0.95，而对于肝细胞型DILI的鉴别能力较差（AUC<0.9）。相关性分析发现，pyroGluGly与GGT水平正相关（r=0.67），Phe与ALP正相关（r=0.45），而PheTrp与AST和LDH负相关（r=-0.43和-0.40）。多元回归分析证实，DILI是影响这些标志物水平的主要因素，患者年龄对Phe有额外贡献。

鉴别其他肝病的能力

pyroGluGly在混合/胆汁淤积型DILI患者中浓度显著高于其他肝病（除OJ外），且在ALP>360 U/L的患者亚组中仍保持高鉴别力（AUC>0.9）。Phe和PheTrp的鉴别能力稍弱，尤其在ALP升高亚组中仅对部分肝病有效。PyroGluGly针对病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝损伤、MASLD/MASH、PBC、肝硬化和HCC的AUC均>0.9，表明其作为混合/胆汁淤积型DILI特异性标志物的潜力。

讨论

本研究通过代谢组学发现并验证了pyroGluGly、Phe和PheTrp作为混合/胆汁淤积型DILI的新型生物标志物。这些标志物在鉴别DILI与其他肝病方面表现出优异性能，尤其pyroGluGly在ALP升高背景下仍具高特异性。其机制可能与肝脏代谢的区带异质性有关，例如苯丙氨酸羟化酶等酶类主要分布于门脉周围区域，胆汁淤积可能影响其活性，导致Phe积累。PheTrp的下降可能涉及二肽酶DPEP1的释放与降解作用。尽管既往研究报道这些代谢物在其他肝病中也有变化，但本研究突出了其对混合/胆汁淤积型DILI的强响应特性。

研究的局限性包括样本量较小、医院间样本处理差异、未控制饮食和饮酒影响等。未来需扩大样本验证这些标志物的临床效用，包括设定截断值和组合评估策略。

结论

PyroGluGly、Phe和PheTrp可作为混合/胆汁淤积型DILI的有效生物标志物，用于临床诊断及与其他肝病的鉴别，具有重要应用前景。