韩国首次对野生动物源蜱中伯氏考克斯体进行分子分型：监测与遗传特征解析

本文首次对韩国野生动物源蜱中伯氏考克斯体（Coxiella burnetii）及考克斯体样细菌（CLB）进行了系统性分子监测与基因分型研究。通过MLVA和MST技术揭示了其遗传特征与欧洲株高度同源，强调了野生动物（如水鹿、貉和獾等）在Q热传播中的生态重要性，为“One Health”策略下的病原监测和防控提供了关键科学依据。

1. 引言

Q热是由专性胞内寄生菌伯氏考克斯体（Coxiella burnetii）引起的人兽共患病，其在环境中存活能力强，宿主范围广泛。近年来，野生动物及其寄生蜱类被确认为该病原体生态循环中的关键环节，但韩国相关分子数据仍较为缺乏。本研究旨在通过分子检测与最小感染率（MIR）评估，分析韩国不同区域和季节中C. burnetii及考克斯体样细菌（CLB）的分布，并利用多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）和多间隔序列分型（MST）对检出的病原体进行遗传特征解析。

2. 材料与方法

2.1. 伦理批准

所有实验程序均经庆北国立大学机构动物护理与使用委员会批准（批准号KNU 2024-0407）。蜱样本来自野生动物管理研究所捕获的动物，采集过程符合伦理标准，不涉及濒危物种。

2.2. 蜱样本采集与种类鉴定

2024年4月至11月，从韩国16个行政区域的297只野生动物体表采集了2747只蜱，包括韩国水鹿（n＝202）、貉（n＝59）、狍（n＝26）、獾（n＝5）以及刺猬、山兔、鼬、红松鼠和台湾水鹿各一只。经形态学和分子生物学（线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因cox1）鉴定，共发现4种蜱：长角血蜱（Haemaphysalis longicornis，占84.6％）、褐黄血蜱（H. flava）、龟形花蜱（Amblyomma testudinarium）和日本硬蜱（Ixodes nipponensis）。

2.3. DNA提取与分子检测

使用商业试剂盒提取蜱样本基因组DNA，采用巢式PCR扩增16S rRNA基因以检测C. burnetii和CLB，并使用IS1111基因特异性引物进行C. burnetii的PCR检测。阳性对照为既往研究中来自波尔山羊的C. burnetii阳性样本及马源CLB样本。

2.4–2.6. 基因分型与测序分析

对PCR阳性样本进行MLVA（使用Ms23、Ms24、Ms27、Ms28、Ms33、Ms34六个位点）和MST（使用Cox2、Cox5、Cox18等十个间隔区）分型。扩增产物经测序后，通过CLUSTAL Omega和MEGA6等软件进行序列比对和系统发育分析。

2.7. 统计分析

使用GraphPad Prism 5.04进行统计学分析，采用Pearson卡方检验分析多变量列联表，以p ≤ 0.05为显著性水平。

3. 结果

3.1. 蜱种鉴定与地域分布

从297只野生动物中共采集2747只蜱，分属2072个池。长角血蜱为绝对优势种（2325只），其次为日本硬蜱（295只）、褐黄血蜱（120只）和龟形花蜱（7只）。采样覆盖全国16个省份，其中京畿道（GG）和江原道（GW）蜱数量最多。

3.2. 野生动物宿主分布

野生动物宿主以韩国水鹿为主（202只），其次为貉（59只）和狍（26只）。北部（首尔SU、仁川IC、京畿GG、江原GW）和中部（忠北CB、忠南CN等）地区样本量较大。

3.3. CLB与C. burnetii的蜱种特异性流行率

总MIR显示，CLB为0.3%（8/2747），C. burnetii为2.2%（60/2747）。C. burnetii在褐黄血蜱中感染率最高（MIR＝3.3%），长角血蜱次之（2.4%），而CLB仅见于长角血蜱（0.3%）。

3.4. 区域分布特征

大田（DJ）、庆南（GN）、光州（GJ）和江原（GW）地区的C. burnetii感染率较高（MIR 5.5%–13.5%），CLB则仅在庆南和全北（JB）等地零星检出。

3.5. 时间动态

蜱数量及病原检出率呈现明显季节变化：成虫在6–7月达高峰，幼虫在8–9月增多。C. burnetii的MIR在8月最高（15.3%），CLB仅在4月有较低检出（1.7%）。

3.6. 宿主动物与感染关联

韩国水鹿体表蜱中C. burnetii的检出率最高（MIR＝2.2%），CLB也仅见于该宿主。山兔体表蜱的C. burnetii感染率高达100%，但因样本量小（n＝4），需谨慎解读。

3.7–3.9. 分子分型与系统发育分析

MLVA分析显示所有C. burnetii阳性样本均为同一基因型（4–11–4–5–8–2），与法国山羊胎盘样本分离株高度同源。MST分析显示所有样本均为MST77型，与韩国既往人血样本分离株（登录号CP107268、CP107247）遗传相似性高。CLB的16S rRNA序列属于Clade B，与已知共生菌株一致。

4. 讨论

本研究首次系统报道韩国野生动物源蜱中C. burnetii和CLB的分子流行特征和遗传多样性。长角血蜱为绝对优势媒介种类，韩国水鹿、貉、獾等野生动物可能是病原体的重要保存宿主。时空分布及宿主动物差异显著，提示生态因素在传播循环中起关键作用。基因分型显示流行株与欧洲株高度同源，提示可能存在国际传播路径或历史引入事件。CLB虽感染率低，但其在蜱唾液腺中的定位及遗传多样性提示其潜在生态与致病意义值得进一步研究。

5. 结论

本研究证实韩国野生动物源蜱中存在C. burnetii和CLB的循环，首次完成其MLVA和MST分型，基因型MST77为优势流行株。结果凸显野生动物在Q热传播中的重要作用，强调基于“One Health”策略持续开展分子监测和跨学科合作的必要性。