猪血凝性脑脊髓炎病毒利用二肽基肽酶1作为功能性受体的机制研究

本研究首次发现猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)不依赖唾液酸而通过二肽基肽酶1(DPEP1)受体侵入细胞。通过冷冻电镜和X射线晶体学揭示PHEV刺突蛋白存在独特开放构象，其受体结合域(RBD)与DPEP1的相互作用界面具有保守结构特征。该发现突破了embecovirus亚属冠状病毒必须依赖唾液酸的传统认知，为冠状病毒跨物种传播机制提供了新见解。

在冠状病毒研究领域，embecovirus亚属一直被视为必须依赖唾液酸进行细胞入侵的典型代表。人类季节性冠状病毒HKU1和OC43、牛冠状病毒(BCoV)等成员均被发现需要通过其刺突蛋白N端结构域(NTD)与9-O-乙酰化唾液酸结合，才能触发刺突蛋白构象变化，进而暴露受体结合域(RBD)完成病毒入侵。然而，这种看似保守的入侵机制在猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)研究中出现了令人意外的转折。

PHEV作为一种主要感染猪只的冠状病毒，可引起胃肠道和神经系统症状，对3-4周龄以下的仔猪通常具有致命性。尽管该病毒在养猪场中广泛存在，但对其入侵机制的认识一直存在空白。传统观点认为，作为embecovirus亚属成员，PHEV理应遵循类似的唾液酸依赖性入侵途径。然而，西班牙瓦伦西亚大学系统生物学研究所的Jérémy Dufloo团队与法国巴斯德研究所的Ignacio Fernandez团队合作开展的研究，却揭示了完全不同的分子机制。

研究人员首先通过神经氨酸酶处理实验发现，去除细胞表面的唾液酸对PHEV假病毒入侵仅产生轻微影响（减少20±5.5%），而同样条件下HKU1病毒的入侵则下降40%。更为关键的是，破坏PHEV刺突蛋白唾液酸结合位点的W90A突变体仅导致感染性下降约2倍，而对应的HKU1 W89A突变体则完全丧失感染能力。这一发现初步表明PHEV可能采用与其他embecovirus不同的入侵策略。

为寻找PHEV的真正受体，研究团队系统性地检测了PHEV假病毒在NCI-60人类癌细胞系面板中的感染情况，并将感染效率与7,694个膜相关基因的表达水平进行相关性分析。结果显示，二肽基肽酶1(DPEP1)的表达与病毒感染性呈现最强正相关性（Pearson r=0.766, P<0.0001）。随后的功能验证实验证实，在HEK293T细胞中表达人源DPEP1可使PHEV假病毒感染率从几乎检测不到的水平（0.07±0.04%）显著提升至54±3.6%，且这一效应具有病毒特异性，对SARS-CoV-2和MERS-CoV假病毒没有影响。

研究人员进一步通过生物层干涉技术(BLI)直接证实了PHEV RBD与DPEP1的特异性结合，测得的平衡解离常数(K_d)为1.50±0.31μM。重要的是，DPEP1的酶活性对其受体功能并非必需，催化失活突变体E141D仍能有效介导病毒入侵。竞争实验表明，可溶性DPEP1能够剂量依赖性地抑制真实PHEV病毒在PK-15细胞和猪原代肾细胞中的复制，进一步确认了DPEP1作为功能性受体的地位。

研究的关键突破在于获得了PHEV RBD与猪源DPEP1复合物的高分辨率X射线晶体结构（2.25Å）。结构分析显示，PHEV RBD尖端呈现独特的"开口"形状，由两个"颌部"结构（j1和j2）组成，与DPEP1相互作用界面埋藏面积约1,150Ų。尽管结合亲和力处于微摩尔级别，但界面存在多个氢键和盐桥等极性相互作用，特别是E351_pDPEP1等关键残基对结合至关重要。

更为引人注目的是，冷冻电镜分析发现PHEV刺突蛋白在稳态下即存在多种构象状态：约25%为关闭状态（三个RBD均处于"向下"位置），50%为1-RBD向上状态，13%为2-RBD向上状态，12%为完全开放状态（3-RBD向上）。这与HKU1、OC43等embecovirus刺突蛋白仅存在关闭构象形成鲜明对比。局部重构显示，PHEV NTD的e1环在无配体情况下即呈现类似HKU1活性构象的状态，这可能解释了为何PHEV不严格依赖唾液酸结合即可发生刺突蛋白开放。

研究还发现，虽然跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)能够增强DPEP1介导的PHEV入侵（提高1.6-3.6倍），但其本身并不能作为独立受体发挥作用。蛋白酶抑制剂实验表明，PHEV主要依赖半胱氨酸蛋白酶而非丝氨酸蛋白酶进行细胞入侵。

物种特异性分析显示，DPEP1作为受体的特性仅限于PHEV，其他betacoronavirus 1成员如OC43、BCoV等均不能利用DPEP1进行细胞入侵。系统发育分析表明，PHEV RBD中存在一个约35个氨基酸的高度可变区域（残基499-534），这可能决定了其独特的受体特异性。有趣的是，尽管PHEV是猪特异性病毒，但其刺突蛋白能够有效利用人源DPEP1，提示其具有潜在的跨物种传播能力。

本研究采用的关键技术方法包括：假病毒系统评估病毒入侵效率、CRISPR-Cas9基因敲除验证受体功能、生物层干涉技术(BLI)测定蛋白-蛋白相互作用亲和力、X射线晶体学解析复合物三维结构（分辨率2.25Å）、冷冻电镜分析刺突蛋白构态动态（分辨率3.4-4.4Å）、细胞-细胞融合实验验证受体介导的膜融合活性。NCI-60人类癌细胞系面板来源于美国国家癌症研究所，猪原代肾细胞由美国农业部国家兽医服务实验室提供。

DPEP1是PHEV特异性受体

通过检测多种betacoronavirus 1成员刺突蛋白与DPEP1的结合能力，研究人员发现仅PHEV刺突蛋白能够与DPEP1特异性结合。细胞-细胞融合实验进一步证实，不同物种（人、猪、牛、犬）的DPEP1直系同源物均只能介导PHEV刺突蛋白引发的膜融合，而对OC43、BCoV等病毒的刺突蛋白无响应。这一发现表明，DPEP1的使用是PHEV特有的进化适应，而非betacoronavirus 1成员的共同特征。

关键残基的功能验证

通过点突变分析，研究人员确定了PHEV刺突蛋白与DPEP1相互作用界面的关键残基。刺突蛋白的F507R和W533A突变几乎完全消除了假病毒感染能力，并使细胞-细胞融合活性下降超过10倍。相应地，DPEP1的E351R突变也完全阻断了病毒入侵，表明该残基在受体-病毒相互作用中起关键作用。物种间比较发现，欧洲野兔等物种的DPEP1在351位点为精氨酸而非谷氨酸，这解释了为何这些物种的DPEP1不能有效介导PHEV入侵。

刺突蛋白构态动态分析

冷冻电镜结构分析揭示了PHEV刺突蛋白独特的构态平衡。与其他embecovirus不同，PHEV刺突蛋白在无配体情况下即存在相当比例的开放构象，且唾液酸结合仅起稳定作用而非构象变化的触发因素。当刺突蛋白与9-O-乙酰化唾液酸孵育后，开放构象的比例有所增加，但构象变化幅度远小于HKU1。这种内在的构态灵活性可能补偿了PHEV RBD与DPEP1相对较低的亲和力。

DPEP1仅与开放构象刺突蛋白结合

通过将RBD-DPEP1晶体结构拟合到关闭状态的刺突蛋白电镜密度图中，研究人员发现DPEP1无法与处于"向下"位置的RBD结合，因为其αb-α1环和N57连接的糖链会与相邻原体的RBD发生空间冲突。这表明刺突蛋白的开放构象是DPEP1结合的前提条件，而受体结合又进一步稳定了开放状态。

本研究首次鉴定了DPEP1作为冠状病毒的功能性受体，打破了embecovirus必须依赖唾液酸入侵的传统认知。研究发现PHEV刺突蛋白具有内在构态动态，能够在无唾液酸配体情况下自发开放，这一特性使其入侵机制更接近SARS-CoV-2而非HKU1。尽管PHEV RBD序列高度变异，但其与受体结合的结构基础在embecovirus中保持保守，体现了冠状病毒RBD结构的惊人可塑性。

该研究不仅为PHEV的防治提供了新靶点，也为理解冠状病毒受体使用的进化提供了重要见解。DPEP1在肾脏和胃肠道中的高表达与PHEV的致病特征相符，但该受体在脑中低表达的情况也提示PHEV神经侵袭可能涉及其他辅助因子。未来研究需要进一步探索PHEV的跨物种传播潜力，以及DPEP1使用性在betacoronavirus 1物种中的进化起源。