中国标题：中国特有等足类蒙古陆鼠妇（Mongoloniscus sinensis）的群体遗传学与华北多样化动态研究

本研究通过多基因谱系地理学分析，揭示了中国特有土壤等足类蒙古陆鼠妇（Mongoloniscus sinensis）在华北地区的遗传分化模式与历史动态。结合生态位模型（SDM）和群体遗传学方法，文章阐明太行山、吕梁山等地理屏障及第四纪气候振荡（如LGM）如何驱动物种分化、限制基因流（FST 达0.911），并指出中部群体为遗传多样性中心（Hd=0.982，π=0.0347），为理解北方温带特有种的生物地理演化提供了关键案例。

1 引言

探究物种分布格局的形成机制是生物地理学和进化生物学的核心议题。现存物种的进化轨迹和遗传分化深受历史地理隔离的影响，尤其是山脉隆升和更新世冰期-间冰期气候波动所导致的变化。自更新世以来，反复的冰川-间冰期旋回引发了许多动植物类群的大范围分布区收缩与扩张，这些动态常与种群瓶颈和遗传漂变相结合，促进了遗传差异的形成和独特谱系地理格局的出现。

线粒体DNA（mtDNA）因其母系遗传、较核基因组更快的突变速率以及缺乏遗传重组等特性，被广泛应用于谱系地理学和群体遗传学研究。这些特性使mtDNA特别适用于重建进化历史和推断历史种群动态。

等足目（Oniscidea）是甲壳动物中几乎完全陆生的类群，也是等足目中多样性最丰富、数量最多的分类单元。尽管等足类全球分布，但由于其迁移能力低且依赖潮湿微生境，扩散能力有限，这使它们成为研究精细尺度谱系地理格局和历史多样化过程的理想模型。近期关于等足类的谱系地理研究主要聚焦于岛屿和水生物种，迄今仅有一项研究探讨了地中海地区陆生等足类 Armadillo officinalis 的谱系地理格局，揭示了古地理历史和近期人类活动如何影响其遗传结构。

本研究以蒙古陆鼠妇（Mongoloniscus sinensis）为对象，这是一种土壤栖息的等足类动物， endemic 于中国北方的温带区域。该物种因能够耐受和富集锌（Zn）、镉（Cd）等重金属而具有重要生态功能，是土壤污染的重要生物指示剂。先前基于线粒体COI序列的初步群体遗传研究显示了蒙古陆鼠妇的遗传多样性证据，但该研究地理范围有限，未评估更广泛的谱系地理格局或历史过程。因此，开展具有广泛空间取样的全面谱系地理研究，对阐明其进化历史及促进对等足目和Agnaridae科生物地理多样化的一般理解具有重要意义。

与青藏高原和中国亚热带地区广泛的谱系地理研究相比，华北地区的类群研究相对较少。仅有限的研究探索了该地区的生物地理格局，包括植物、蜘蛛（如 Sinothela 和 Ganthela）以及蜥蜴（如 Eremias argus 和 E. brenchleyi）等。华北地区几条突出的山脉——如泰山、太行山和吕梁山——被认为是历史的谱系地理屏障，限制了基因流并促进了谱系分化。特别是太行山（北纬35°至40°）形成了中国第二阶梯（海拔1000–2000米）和第三阶梯（海拔<500米）之间的自然分界线，因其生态和气候意义被确定为潜在的谱系地理边界和生物多样性中心。该地区地形、土壤类型、气候和植被高度异质，物种丰富度高，并可能在第四纪提供了冰川避难所。同样，纵贯山西西部的吕梁山也被认为影响了地方特有生物区的形成。

本研究调查了蒙古陆鼠妇的谱系地理，该物种是中国温带北部特有的一种陆生等足类。我们从48个地点采集了305个个体，覆盖了该物种已知分布的大部分区域。利用三个线粒体标记（COI、ND5和12S rRNA）结合生态位模型，进行了系统发育和群体遗传分析。主要目标是：（1）描述蒙古陆鼠妇在其分布区内的谱系地理模式；（2）评估古地理事件和第四纪气候波动在多大程度上塑造了遗传多样性和种群结构。

2 材料与方法

2.1 取样与实验室流程

从蒙古陆鼠妇的天然分布区——中国北方的48个采样点共采集305个个体。每个地点的地理位置已标注于图中，详细信息见表1。所有标本保存在100%乙醇中，并贮存于山西师范大学生命科学学院（山西，中国）的-20°C环境中。使用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒（Solarbio, China）从步足提取基因组DNA。对所有个体扩增三个线粒体标记：12S小亚基rRNA（12S）、细胞色素c氧化酶亚基I（COI）和NADH脱氢酶亚基5（ND5）。PCR引物借鉴自先前已发表的研究，PCR扩增程序列于表S1。测序由生工生物（北京）采用Sanger测序技术进行双向测序。色谱图导入Geneious 2020.2.1进行人工检查，通过质量分数评估推定杂合位点并经色谱图视觉验证。未观察到双峰，所有序列被视为真实线粒体单倍型。序列使用MAFFT 7.402的G-INS-I策略进行比对，使用GBLOCKS去除比对不良区域。最终比对包括COI（603 bp）、ND5（375 bp）和12S rRNA（456 bp），并用PhyloSuite 1.2.2进行串联。

2.2 遗传多态性、系统发育分析与群体遗传结构

基于串联线粒体数据，通过多态位点数（S）、单倍型数（Nhap）、单倍型多样性（Hd）和核苷酸多样性（π）等遗传多样性指标进行计算，这些指标在DnaSP v5.0中计算。使用SplitsTree v4.14.5中的Neighbor-Net（NN）方法进行系统发育分析，该方法基于配对未校正P距离创建距离矩阵。使用BAPS v6.0进行群体结构贝叶斯分析，整合地理坐标和遗传数据以估计最佳遗传组数量（K=1–10）。最佳K值基于10次重复中的最高边际对数似然值选择。使用PopArt v1.7中的TCS算法构建串联数据集的单倍型网络，以可视化单倍型间关系。

计算配对F_ST值，并使用Arlequin 3.5进行分层分子方差分析（AMOVA），设定K=3（来自BAPS结果）和5000次置换以量化遗传变异。

2.3 历史种群统计与分化时间估计

通过错配分布分析评估每个种群组和所有蒙古陆鼠妇种群的历史统计动态，分析在DnaSP v5.0中进行。计算Tajima's D和Fu's F_S以进一步估计潜在的扩张事件。为确保准确估计分化时间，我们排除了在网络中显示混合单倍型组关联的地点样本。使用BEAST 2.6.2估计分化时间，采用严格时钟模型和恒定规模合并先验。时间尺度使用COI替代速率（1.56%–1.72%/百万年）进行校准，该速率先前为等足目估计。马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）链运行1000万代，每1000代采样一次。使用Tracer 1.6确认收敛和有效样本大小（ESS>200）。在丢弃前25%的树作为燃烧期后，使用TREEANNOTATOR v.2.4.1确定最大 clade 可信度树。

2.4 基因流估计

为推断基因流的速率和方向，使用MIGRATE v4.4.3估计每代迁移个体数。个体分配基于上述遗传结构结果。参数设置如下：long-inc=100, long-steps=1,000,000, burn-in=100,000。进行四次独立MCMC运行，每次运行一百万个世代，前10%的样本作为燃烧期丢弃。三个独立MCMC估计值之间的一致性，以及所有三个估计在先验范围内的平滑单峰分布，被视为收敛的标志。通过比较三种不同基因流方向模型的边际似然来选择最佳模型。

2.5 当前与过去的物种分布模型

使用我们野外工作中的48个出现记录来模拟蒙古陆鼠妇当前和过去的分布。为减少空间自相关的影响，保留彼此相距50公里以上的43个地点用于物种分布模型（SDM）。使用WorldClim数据库的19个生物气候变量，分辨率为2.5弧分，其中在去除高相关变量（|r|>0.80）后保留了7个：最冷季度平均温度（BIO11）、最湿月降水量（BIO13）、降水量季节性（BIO15）、最冷季度降水量（BIO19）等。在Maxent 3.4.4中实施最大熵模型来预测蒙古陆鼠妇的物种分布范围。分析使用默认设置运行，75%的记录用于训练，25%用于模型测试。将模型投影到CCSM3模拟的末次盛冰期（LGM）的气候条件下。使用受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）评估模型性能。

3 结果

3.1 遗传多态性与系统发育分析

从305个个体中生成了915条新的线粒体序列，靶向三个基因片段：COI、ND5和12S基因。串联序列总长1434个碱基对，包含148个线粒体单倍型。单倍型多样性（Hd）范围从0.000到1.000。Neighbor-Net系统发育树揭示了三个遗传谱系，对应于东、中和西组，由BAPS聚类和其地理位置定义。这些谱系根据BAPS结果进行颜色编码。三组的核苷酸多态性总结于表S2。中部组表现出最高的单倍型和核苷酸多样性（Hd=0.982；π=0.0347），尽管其样本量小于其他组，而东部组显示出最低的多样性水平（Hd=0.823；π=0.0029）。

3.2 群体遗传结构

从所有305个样本中鉴定出148个单倍型。在单倍型网络中，东部组和西部组彼此远离，表明显著的遗传分化。中部组的单倍型位于网络中心，可能代表祖先单倍型，而东部和西部单倍型 appear 衍生。中部网络更加网状，暗示更长的历史或更复杂的进化过程。BAPS识别出三个主要遗传簇，地理上对应于东部（如辽宁、北京、天津、河北、山东）、西部（如陕西、山西南部、甘肃）和中部（山西中部/北部和内蒙古）种群。AMOVA显示，总遗传变异的72.62%发生在组间（p<0.01），而20.10%和7.28%分别发生在种群内和组内种群间。配对F_ST值范围从0.3289到0.9110，且全部显著。东部和西部组之间检测到最高水平的遗传分化（0.9110），其次是西部和中部组（0.6077），而最低的是东部和中部组之间（0.3289）。

3.3 人口历史

为评估过去的人口动态，我们进行了错配分布分析和中性检验。东部和西部组的观察和预期错配分布均显示单峰模式，表明近期的人口扩张。这一推断得到了Tajima's D和Fu's F_S显著负值的进一步支持。相比之下，中部组和完整数据集在错配分布分析中显示多峰分布。

3.4 分化时间

基于串联线粒体序列的分化时间估计表明，蒙古陆鼠妇始于晚上新世多样化，大约在2.61百万年前（Ma）。东部和西部组在中更新世从中部分化，分别大约在0.63 Ma和0.53 Ma。

3.5 迁移率分析

迁移分析揭示了中部组与东/西部组之间的不对称历史基因流。东部和西部组之间未检测到基因交换。从东部到中部的迁移个体数高于反向方向（257.7对13.0），从西部到中部组也有类似模式（68.3对35.7）。

3.6 生态位建模

生态位模型表现出良好的预测能力，所有模型表现良好（AUC>0.8）。预测的当前分布与观察到的出现密切匹配，显示了中国北方的广泛连续分布范围。在LGM气候条件下，蒙古陆鼠妇的高适宜栖息地集中在太行山东南部。从晚更新世到现在，适宜栖息地的向北扩张表明，蒙古陆鼠妇的分布受到冰川旋回的强烈影响。我们的结果表明，从LGM到现在，该物种的栖息地在中国的温带地区大致连续。

4 讨论

4.1 蒙古陆鼠妇的遗传多样性与种群结构

谱系地理和群体遗传学分析为了解塑造物种分布的进化过程提供了关键见解，并为生物多样性保护提供了重要框架。特有种对区域生物多样性贡献显著，常常是保护工作的焦点。本研究调查了蒙古陆鼠妇的遗传结构，该物种是中国温带特有的一种等足类，以重建其谱系地理历史。在种群水平上，北方种群表现出相对较高的遗传多样性，与先前基于COI序列的发现一致。在本研究中，我们为蒙古陆鼠妇识别出一个清晰解析的种群结构，包括三个主要遗传簇——东、西和中部支系，得到了neighbor-net树、BAPS分析和单倍型网络分析的一致支持。这些分析一致证明了西部和东部组之间的清晰划分，中部组与两者都有密切关系。值得注意的是，中部组显示出高单倍型和核苷酸多样性，表明保留了祖先多态性。观察到的模式得到了AMOVA结果的进一步证实，AMOVA显示了组间显著的分子方差。配对F_ST值也反映了强烈的种群差异，东部和西部组之间遗传分化最大，中部组与其他两组之间的分化相对较低，支持了东部和西部种群可能都源自一个祖先中部种群的假设，该种群可能位于太行山和吕梁山周围。基因流分析揭示了东部和西部组之间的连通性有限，加强了这些种群实际上被隔离的观点。总之，观察到的种群结构可能是由山脉屏障的历史隔离和陆生等足类低扩散能力共同塑造的。

4.2 谱系地理模式与人口历史推断

线粒体数据强烈支持蒙古陆鼠妇存在三个主要组。人口重建表明东部和西部种群近期都有种群扩张，证据是单峰错配分布和中性检验中的显著负值。相比之下，中部组似乎保持了相对恒定的种群规模。内蒙古（NMHH）和宁夏北部（NXSH）的两个采样点与中部组聚类，尽管它们远离其核心分布区。这种模式可能归因于人为传播，因为野外观察表明蒙古陆鼠妇经常与人类活动相关，暗示了人为介导的范围扩张潜力。

为阐明观察到的谱系地理结构背后的历史过程，我们估计了主要支系之间的分化时间。中部支系与西部/东部支系的分化分别大约在0.63/0.53 Ma，将它们的分化明确置于更新世内。这一时期以反复的冰川-间冰期旋回为标志，导致了第四纪频繁的气候波动，可能影响了栖息地连通性，从而塑造了种群片段化和扩张。具体而言，尽管中国北方在第四纪未被冰盖覆盖，但它经历了剧烈的气候波动。冰川期间的适宜栖息地可能充当了避难所，促进了冰期后的重新殖民。此外，东部支系 appear 最近分化，这可能解释了其相对较低的遗传多样性。地质事件和物理屏障（如山脉或河流）的出现，通过限制种群间的扩散和基因流，在促进变异分化中发挥了关键作用。就蒙古陆鼠妇而言，识别出两个主要谱系地理边界。第一个将中部和东部支系分开，对应于太行山的南北延伸，并与一个已知的构造边界一致。青藏高原（QTP）的间歇性活动，从大约3.5到1.6 Ma（上新世晚期到更新世时期），驱动了太行山在更新世的快速隆升。太行山海拔高达约2800米，以深沟巨谷为特征。这种复杂的地形是中国北方的重要地理屏障，导致种群片段化、基因流减少和栖息地异质性增加。蒙古陆鼠妇中观察到的遗传不连续性可能反映了这座山的隔离效应。第二个边界将中部和西部支系分开，空间上对应于吕梁山，位于山西省西部。该山脉延伸约350公里，海拔在1500到2830米之间。吕梁山自晚白垩世以来经历了多个隆升阶段，其现代地形配置形成于早更新世中期。与太行山类似，吕梁山脉可能通过作为物理扩散屏障促进了种群隔离和谱系分化。总之，这些发现支持了一个 scenario，其中地理屏障（太行山和吕梁山）和第四纪气候振荡共同促进了蒙古陆鼠妇的谱系隔离和区域分化。

蒙古陆鼠妇中观察到的谱系地理模式与整个中国北方更广泛的生物地理过程一致。例如，东西谱系地理分裂已在诸如梨 Pyrus betulaefolia、蜥蜴 Eremias argus 和 E. brenchleyi 以及蚂蚁 Camponotus japonicus 等物种中被识别。类似地，由地质特征和更新世气候振荡塑造的谱系多样化也在其他地区和类群中被报道。例如，横跨欧亚的广布植物 Elymus sibiricus 的谱系多样化与青藏高原隆升和更新世气候振荡有关。同样，在地中海地区，池龟 Mauremys leprosa 表现出由地理特征（如摩洛哥山脉和直布罗陀海峡）结合更新世气候振荡塑造的谱系地理结构。

尽管我们当前的研究仅依赖于线粒体标记，但结果仍然揭示了种群间清晰定义的遗传结构。然而，线粒体DNA在谱系地理推断中有固有局限性。作为非重组、母系遗传的标记，mtDNA仅反映单一谱系历史，这限制了其检测杂交事件的能力，并可能无法捕捉由双亲遗传塑造的种群结构的全貌。此外，核线粒体假基因（NUMTs）的存在如果在无意中被扩增可能会混淆分析。为最小化这种风险，我们仔细检查了色谱图以避免包含异质或假基因样序列。尽管我们基于线粒体的数据集产生了稳健的谱系地理模式，未来结合全基因组核SNP数据的工作将增强分辨率并探索蒙古陆鼠妇潜在的局部适应机制。

4.3 蒙古陆鼠妇特有分布的意义

作为中国北方特有物种，蒙古陆鼠妇观察到的分布模式和遗传分化可能由地质历史、第四纪气候波动和内在生物学特性的共同影响所塑造。蒙古陆鼠妇局限于古北区，其南部分布边界受秦岭和淮河限制。秦岭山脉是显著的地形和生态屏障，将中国分为温带北方和亚热带南方。生态位模型将最冷季度平均温度（bio11）确定为决定物种分布的最重要变量（44.5%），其次是最冷季度降水量（bio19, 20%）和海拔（13.5%），表明该物种具有很强的冷适应属性。与我们的发现一致，秦岭山脉也被认为是跨类群的关键谱系地理屏障，通过限制物种扩散加强了区域特有性。