核心外连接蛋白CFAP77在纤毛和鞭毛双联微管中连接A管与B管的作用机制研究

本文聚焦于纤毛和鞭毛轴丝双联微管（DMTs）结构稳定性维持的核心机制。研究通过构建Cfap77基因敲除（KO）小鼠模型，结合冷冻电子断层扫描（cryo-ET）等前沿技术，首次在哺乳动物中证实外连接（OJ）蛋白CFAP77对于维持DMTs中A管与B管的连接至关重要。CFAP77的缺失会导致其与CCDC105、TEX43形成的三元亚基复合物解离，进而引发OJ区域B管的开放，最终导致精子运动能力（如前进运动能力）缺陷和雄性不育。该研究不仅揭示了CFAP77在DMTs结构组装中的关键作用，也为理解相关男性不育症（如弱精子症）的病因提供了新的分子视角。

引言

纤毛和鞭毛是真核细胞表面突出的细胞器，在感觉过程、运动和人类生理中扮演多种角色。运动纤毛的核心结构——轴丝，由一对称为中央对复合物（CPC）的微管单体和九个周边定位的双联微管（DMTs）组成，形成“9+2”结构。每个DMT具有独特的结构，包含一个完整的13根原纤维环（A管）和一个不完整的10根原纤维环（B管）。DMTs与一组轴丝复合物（如外力和内动力蛋白臂、放射辐和连接蛋白-动力蛋白调节复合物）锚定在一起。B管与A管的连接被认为对于轴丝的稳定性和纤毛/鞭毛的运动性至关重要。然而，在哺乳动物纤毛/鞭毛中，B管与A管连接形成DMTs的机制尚不清楚。内连接（IJ）蛋白和外连接（OJ）蛋白被认为是介导这种连接的关键。CFAP77被鉴定为DMTs中OJ的一个组分，其在多种物种和细胞类型中保守。本研究通过生成Cfap77-KO小鼠，旨在揭示CFAP77在哺乳动物轴丝A管和B管连接中的生理作用及其潜在的结构/分子机制。

CFAP77-CCDC105-TEX43亚基复合物在精子DMTs的OJ区域

近期对小鼠精子轴丝DMTs的近原子级结构解析，为了解单个DMT结构组分的功能提供了宝贵资源。CFAP77、CCDC105和TEX43因其位于OJ区域而引人注目，它们可能在精子DMTs内B管与A管的连接中发挥重要作用。结构模型显示，在小鼠精子中，CFAP77以16 nm的重复周期结合在A11-A12和B01-B02原纤维上。CCDC105位于A11和A12原纤维之间，通过与相邻的CCDC105分子相互作用组装成长丝。CCDC105丝似乎将单个CFAP77蛋白连接成一个稳定的结构，以连接A管和B管。TEX43位于两个CCDC105蛋白的连接处，提示其在增强CCDC105丝稳定性方面发挥作用。CFAP77、CCDC105和TEX43之间存在大量紧密的相互作用。共免疫沉淀（co-IP）分析验证了该三元亚基复合物中的相互作用，证实CCDC105与CFAP77和TEX43均存在相互作用，但CFAP77与TEX43之间没有直接相互作用。突变CFAP77和CCDC105关键相互作用界面的残基，会明显减弱它们之间的结合。这些结果表明，OJ区域的CFAP77-CCDC105-TEX43亚基复合物对于DMTs的A管与B管连接及精子运动性可能至关重要。

Cfap77-KO雄性小鼠不育并产生有运动缺陷的精子

为揭示CFAP77在哺乳动物中的生理作用，研究人员通过CRISPR/Cas9技术生成了Cfap77-KO小鼠品系。Western blot分析证实敲除小鼠精子样本中CFAP77表达完全缺失。Cfap77-KO小鼠健康且发育正常，但生育力测试显示Cfap77-KO雄性小鼠不育。体外受精（IVF）实验表明，使用Cfap77-KO小鼠精子时，卵裂球（2细胞胚胎）的比例显著低于野生型（WT）对照组。然而，使用透明带缺失的卵母细胞时，Cfap77-KO精子产生的2细胞胚胎比例与对照组相当，表明CFAP77的缺失不影响精子-卵子融合或基因组完整性。Cfap77-KO小鼠睾丸和附睾尾的组织学检查显示精子发生和精子产生过程正常。精液特性分析显示，Cfap77-KO小鼠的精子形态大体正常，精子数量与WT小鼠相似，但精子的前进运动能力显著减弱。精子运动轨迹追踪和统计分析发现，Cfap77-KO小鼠中呈现S形、O形以及摇摆/静止运动的精子比例显著增加。这些发现表明，CFAP77对于小鼠精子的前进运动能力和雄性生育力至关重要。

Cfap77-KO小鼠精子中OJ区域开放的DMT B管

为探究Cfap77-KO小鼠精子运动能力受损的结构基础，研究人员通过传统透射电子显微镜（TEM）检查了精子鞭毛轴丝的超微结构。Cfap77-KO小鼠与WT小鼠在顶体、CPC、放射辐、动力蛋白臂以及轴丝的附属结构（如线粒体鞘和纤维鞘）的超微结构上无法区分。A管和B管在DMTs内的断开是CFAP77缺失后唯一明显的超微结构缺陷。WT小鼠的精子呈现组织良好的“9+2”轴丝，DMT B管紧密附着在DMT A管上。相比之下，Cfap77-KO小鼠中很大比例的精子出现缺陷， specifically 位于A管和B管的连接部位（OJ区域开放的DMT B管）。在Cfap77-KO小鼠的轴丝中，A管和B管的断开主要分布在DMTs 1、4、5、6和9。统计分析显示，CFAP77蛋白缺失后，具有开放DMT B管的轴丝百分比显著增加（WT小鼠为6.67% ± 1.453%，Cfap77-KO小鼠为45.33% ± 3.480%）。在Cfap77-KO小鼠中，精子鞭毛中段和主段之间的这一比例没有明显差异。有趣的是，精子获能1小时后，Cfap77-KO小鼠中A管和B管断开的比例进一步增加，表明在精子超活化过程中轴丝的不稳定性增加。Cfap77-KO小鼠中OJ区域特异性出现开放DMT B管的表型，与WT DMTs结构数据显示CFAP77选择性定位于DMTs的OJ区域相一致。超微结构分析清楚地表明，DMTs内A管和B管的分离是Cfap77-KO小鼠精子前进运动能力受损的根本原因。

对Cfap77-KO小鼠精子DMTs细胞内结构的洞察

为在相对高分辨率下研究CFAP77缺失对精子DMTs结构组装的影响，研究人员将Cfap77-KO小鼠的精子冷冻在载网上，并通过冷冻聚焦离子束减薄（cryo-FIB）将样品减薄至约200 nm厚。他们收集了针对精子尾部的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据，并利用子断层图平均（STA）方法解析了DMTs的细胞内结构。在颗粒挑选和数据处理过程中，发现DMT颗粒呈现显著的结构异质性，表明Cfap77-KO小鼠精子DMTs的超微结构受损。这一发现与常规TEM观察结果一致，即Cfap77-KO小鼠精子中约45%的DMT B管在OJ区域开放。经过3D分类丢弃许多颗粒后，获得了分辨率为24 Å的DMTs 8 nm重复结构。通过从WT 8 nm重复图中减去Cfap77-KO图的密度，生成的差异图证实，Cfap77-KO小鼠DMT结构缺失的主要部分是沿着靠近A11原纤维的微管壁纵向延伸的长纤维状密度。随后，将WT小鼠精子DMT结构的原子模型拟合到Cfap77-KO小鼠精子DMTs的密度图中，发现CFAP77、CCDC105和TEX43被鉴定为Cfap77-KO小鼠精子DMT B管中缺失的密度。CFAP77相应密度的缺失如其基因敲除所预期，但CCDC105和TEX43的缺失突显了CFAP77在形成CFAP77-CCDC105-TEX43三元复合物中的关键作用。此外，应用聚焦分类技术，揭示了OJ区域存在不同状态的连接弱化，表明许多看似完整的DMTs已经存在OJ处的早期断裂。这些细胞内结构研究提供了直接的视觉证据，表明OJ区域CFAP77-CCDC105-TEX43亚基复合物的缺失是导致Cfap77-KO小鼠精子轴丝开放DMT B管形成的起始事件。

CFAP77缺失后睾丸和精子中的CCDC105和TEX43蛋白丢失

鉴于Cfap77-KO小鼠与WT小鼠的精子数量和形态高度相似，研究人员进一步应用质谱分析法定量鉴定了WT和Cfap77-KO小鼠的精子蛋白质组。与WT组相比，CCDC105和TEX43蛋白在Cfap77-KO小鼠的精子样本中显著下调。这一蛋白质组学发现与Cfap77-KO小鼠精子DMTs的原位结构分析结果一致，后者揭示了OJ区域CFAP77-CCDC105-TEX43亚基复合物的缺失。通过Western blot分析进一步证实，在Cfap77-KO小鼠的睾丸和精子样本中，几乎检测不到CCDC105和TEX43的表达。然而，Cfap77基因敲除后，Ccdc105和Tex43的mRNA水平未发生改变，表明CFAP77在蛋白质水平而非mRNA水平影响CCDC105和TEX43的表达/稳定性。

CFAP77对小鼠其他纤毛组织的影响

CFAP77是真核有纤毛生物中轴丝DMTs广泛保守的OJ蛋白。相比之下，CCDC105和TEX43是两种精子特异性的微管内蛋白。精子具有单一、长的鞭毛，并在长距离迁移后经历超活化以受精卵子。因此，预计需要CCDC105和TEX43来进一步强化精子轴丝DMTs内OJ的稳定性。Cfap77 mRNA在小鼠睾丸和附睾中高表达，但在其他类型组织中也有表达。鉴于CFAP77也在其他类型纤毛中表达，研究人员进一步检测了CFAP77对小鼠室管膜纤毛、气管纤毛和鼻纤毛的影响。Cfap77-KO小鼠健康，且未表现出明显的纤毛功能障碍症状，包括左右不对称异常、脑积水或呼吸问题。扫描电镜显示，Cfap77-KO小鼠与WT小鼠在室管膜、气管和鼻腔的纤毛层形态上无法区分。此外，通过常规TEM检查了气管纤毛轴丝的超微结构。CFAP77蛋白缺失后，气管纤毛中具有OJ区域开放DMT B管的轴丝百分比显著增加（WT小鼠为5.33% ± 1.76%，Cfap77-KO小鼠为29.33% ± 1.76%）。然而，气管纤毛轴丝中A管和B管断开的这一比例（低于30%）低于在精子中观察到的比例（约45%）。综上所述，本研究揭示，敲除核心OJ蛋白CFAP77会导致（i）OJ区域CFAP77-CCDC105-TEX43亚基复合物的丢失，（ii）OJ部位特异性出现开放的DMT B管，以及（iii）小鼠轴丝不稳定和精子运动异常。

讨论

轴丝作为一种巨大的分子机器，是由九个DMTs围绕一个CPC形成的圆柱状排列。研究轴丝组织对于理解纤毛生物学和诊断纤毛病至关重要。每个DMT的A管和B管在称为OJ和IJ的区域连接。轴丝领域的关键问题之一是OJ和IJ如何工作以连接DMTs内的A管和B管。高分辨率结构分析和基因敲除模型提供了有用信息。CFAP77被鉴定为OJ的一个组分。CFAP77的缺失会导致四膜虫和小鼠纤毛/鞭毛（本研究）中形成开放的DMT B管，表明CFAP77是轴丝中DMT A管和B管连接进化上保守的OJ组分。B管在A管表面成核。一项体外DMT组装研究表明，移除A10和A11原纤维的C末端尾部允许从B01原纤维成核B管。在Cfap77-KO小鼠中，仅在约一半的DMTs中观察到OJ区域特异性开放的B管，而许多A管和B管保持完整。本研究指出CFAP77对于B管形成并非必需，但 specifically 对于OJ的稳定性是必需的。研究发现，在Cfap77-KO小鼠精子轴丝中，A管和B管的断开主要分布在DMTs 1、4、5、6和9。其原因尚不清楚，可能与哺乳动物精子轴丝的不对称结构以及搏动过程中受力不均有关。高分辨率信息结合基因编辑动物模型（可能还有人类患者样本）的原位结构生物学，建立了一个研究轴丝的范式。尽管CFAP77在轴丝和精子运动性中的生理作用似乎比其与CCDC105和TEX43的相互作用更为重要，但CFAP77-CCDC105-TEX43亚基复合物的缺陷可能是具有弱精子症的人类男性不育的潜在遗传原因。