微生物生物肥料为提升农业生产力提供了一种可持续的方法，通过减少对化学肥料的依赖。本研究从大豆根际土壤中分离出193株细菌，并利用高通量测序技术进行遗传多样性分析。通过IS-PCR指纹图谱筛选出19株代表性菌株，随后通过16S rRNA测序确定了其中的主要属为芽孢杆菌（*Bacillus*）、根瘤菌（*Rhizobium*）和短芽孢杆菌（*Paenibacillus*）。在这些菌株中，根瘤菌属的TY15因其在根际中的主导地位和其促进植物生长的特性被选定为主要研究对象。该菌株在磷和钾的溶解能力、植物生长促进特性（如生长素合成和酶活性）以及对抗植物病原菌（如尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和茄科细菌病原菌）方面表现出显著的功能性。值得注意的是，TY15不仅能够促进大豆的生长，还能调节根际微生物群落结构，显著提高有益菌属如芽孢杆菌和根瘤菌的丰度。这些发现突显了定向微生物接种在提升作物抗逆性和养分利用效率方面的潜力，为通过优化植物-微生物互作开发可持续生物肥料提供了新的视角。
大豆作为全球重要的粮食、油料和饲料作物，其在食品、油类和动物饲料生产中具有不可替代的地位。中国是全球最大的大豆消费国，然而国内大豆生产仍面临诸多挑战，包括分散的土地所有权、先进品种的推广不足以及农业技术应用有限。目前，80%的大豆种植集中在东北三省，2023年的种植面积达到1060万公顷，占全球种植面积的4%至5%。大豆根际中积累的化感物质会干扰微生物生态系统，导致种子活力下降（发芽率减少15%至20%）、植物生理功能受损以及在严重情况下造成30%至40%的产量损失。这些生物限制因素，加上社会经济因素如小农户主导的生产模式，迫切需要采取措施以增强作物的抗逆性和生产效率。
根际细菌在维持植物健康和提高作物产量方面发挥着关键作用。根际是土壤中紧贴根部表面约1毫米的区域，是植物与微生物之间复杂互动的动态界面。这些微生物通过三种协同机制促进植物生长和增强抗逆性：（i）固氮和植物激素分泌（如生长素和细胞分裂素）以刺激细胞扩展和分化；（ii）通过抗菌代谢物的产生和营养竞争来抑制土壤病原菌；（iii）通过溶解氮和磷化合物促进营养循环，从而提高植物对营养物质的吸收效率。除了直接的植物益处，特定的根际细菌还能改善土壤生态系统服务，如降解难降解有机物、增强土壤团聚体稳定性和优化水力特性（水保持能力提高15%至25%，通气性改善20%至40%）。根际微生物群落的功能冗余和分类多样性共同决定了其农业生态潜力，这强调了解植物-微生物互作对于可持续农业系统强化的重要性。
目前，微生物多样性研究主要依赖于培养依赖和非培养依赖方法，各有其优势和局限性。传统培养方法虽然能够对分离的菌株进行功能特性分析，但受到四个关键障碍的限制：（i）对生长缓慢的寡营养菌株的技术敏感度不足（培养率低于1%）；（ii）人工富营养化培养基改变了微生物的行为；（iii）破坏了原生微生物间的相互作用（如群体感应和代谢物交换）；（iv）无法模拟实际土壤中的物理化学梯度（pH和氧张力）。相比之下，非培养依赖方法，特别是高通量宏基因组测序，通过三种变革性属性改变了微生物生态学研究：超高的测序深度（≥50,000 reads/样本）、全面的物种检测（识别>95%的稀有物种）以及低成本处理（<50美元/样本）。通过规避培养偏差，这些方法现在主导了根际微生物群落研究，使得在原生土壤条件下能够精确重建微生物网络和功能基因库存。
在农业生产中，微生物群落通过调节根际微生物相互作用来增强作物对压力的抵抗力，已成为绿色农业中的重要策略。然而，其作用机制和核心功能性微生物群落仍不明确。本研究采用培养依赖和非培养依赖技术对大豆根际细菌进行了筛选，以选择最佳的生长促进和拮抗细菌。在选定菌株的应用后，研究分析了其对大豆根际微生物群落的影响，并展示了该菌株如何重塑根际微生物群落的结构和多样性。
在大豆根际细菌的分离和保存过程中，样本从对照组（CK）和TY15处理组的植物根际土壤中无菌采集。土壤样本在无菌条件下进行机械均质化，随后在层流罩中精确称量10克无根土壤，生成10⁻¹稀释液。土壤在无菌锥形瓶中与90毫升无菌水混合，以确保悬浮液的均匀性。随后，系统地制备了10⁻²至10⁻⁸的十进制稀释液，通过在每个稀释步骤中严格搅拌以保持微生物分布的准确性。从每个稀释梯度中取50微升样本，采用铺板法接种于LB、YMA和PDA培养基上。接种后，在30°C下培养5至8天，每8小时监测菌落形态。形态各异的菌落被拍照记录，并通过火焰灭菌的接种环进行分离，随后进行三阶段划线纯化以获得无菌培养物。为了低温保存，菌株被悬浮于保护剂溶液（20% [体积/体积]甘油、1.5% [重量/体积]脱脂乳和0.5%溴酚蓝）中，并通过涡旋混合5分钟以确保均匀性，最后在−80°C下进行低温保存。
对分离的菌株进行了全面的生理特征分析，使用Bergey手册规定的协议，包括Voges-Proskauer试验、吲哚产生、尿酶活性、胶原酶介导的液化、碳水化合物利用谱（蔗糖/柠檬酸）、氨合成能力以及甲基红试验以验证酸生成能力。此外，还进行了溶血实验，以确定菌株是否具有病原性。溶磷（P）和溶钾（K）能力的评估采用已建立的协议，将菌株接种于Pikovskaya琼脂（用于溶磷）或Aleksandrov琼脂（用于溶钾）上，并在最佳条件下培养。培养3至7天后，通过钼蓝法测定可溶性磷含量，而钾浓度则通过火焰光度计在离心后的上清液中进行测量，效率通过与未处理对照组进行比较计算得出。蛋白酶活性筛查涉及在1%酪蛋白补充的营养琼脂上培养代表菌株，通过观察菌落周围的透明水解区来确认蛋白酶功能。纤维素酶活性检测则采用羧甲基纤维素琼脂平板，通过考马斯蓝染色（0.1%，15分钟）后，用1M NaCl进行脱色以显示酶促水解。生长素（IAA）的产量通过Salkowski试剂反应进行量化。
为了确定铁载体的产生，代表性菌株在LB液体培养基中培养。离心后，将1.0毫升细菌悬液转移到含有5.0毫升MSA-CAS液体培养基的试管中，每株菌在三重复中接种。试管在37°C下以150 rpm摇动培养72小时，通过观察培养基颜色变化确认铁载体的产生。对于乙酰辅酶A脱氨酶，细菌在DF-ACC培养基中培养，细胞裂解后，通过DNPH试剂（540 nm吸光度）检测α-酮戊二酸的产量。这些实验均采用分光光度法进行酶活性的测定。
通过IS-PCR指纹图谱技术对菌株进行分子层面的聚类分析。使用J3引物（5′-GCT CAG GTC AGG TGG CCT GG-3′）进行PCR扩增，这些引物针对保守的重复细菌序列以区分菌株。PCR混合物（总25微升）包括2× Taq PCR Mix（12.5微升）、1.0微升引物（50.0微摩尔/升）、0.5微升模板DNA（40.0纳克/微升）和11.0微升ddH₂O。PCR条件为：95°C下预变性5分钟；随后35个循环，每个循环包括95°C变性50秒、56°C退火50秒和72°C延伸1分钟；最后72°C延伸5分钟。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，随后在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离条带。使用GIS紫外凝胶成像系统对电泳结果进行拍照和聚类分析。
16S rRNA基因的扩增采用27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）引物进行，并通过ABI PRISM 3730基因分析仪进行测序。使用BigDye Terminator版本3.1循环测序试剂盒进行测序。获得的序列与NCBI数据库在EzBioCloud中进行比对，以寻找相似度最高的16S rRNA基因序列。通过ClusterW进行多序列比对，并使用MEGA 11构建系统发育树以确定其系统发育地位。
基于全面的PGPR特性筛选，从菌株中选出四株表现出优越生物活性的PGPR菌株，用于大豆生长促进试验。表面灭菌的大豆种子在无菌水中进行水浸处理（25°C，72小时）后，移植到均匀萌发的种子苗（子根长度：2±0.5厘米）中，放入经过高压灭菌的土壤填充苗床（每组五个生物重复）。培养基在种植前用50毫升蒸馏水（70%田间持水量）预湿润。细菌群落通过100毫升悬浮液灌溉方式在移植后第1、6、11、16、21、26和31天进行施用，对照组则接收相同体积的无菌LB培养基。在控制条件下（25°C，16/8小时光照/黑暗）培养31天后，进行形态测量分析，包括茎长、根系结构量化和生物量测量，通过精确数字成像和重力方法完成。
在实验设计和TY15菌株的施用中，表面灭菌的大豆种子（n=150）在无菌培养皿中用ddH₂O进行水浸处理。经过72小时的控制条件培养（25°C，16/8小时光照/黑暗）后，选择90株均匀萌发的种子（子根长度：2.0±0.3厘米）移植到预称重的盆中，每盆填充标准化的Qilin North Farm土壤（每盆1.2千克干质量）。TY15菌株的接种剂通过在YM培养基中培养48小时（28°C）制备，随后通过离心（8000×g，10分钟）收获细菌细胞，用无菌盐水（0.85% NaCl）洗涤两次，并重悬至标准化密度3.0×10⁹ CFU/mL。此浓缩悬浮液被稀释至1:300（体积/体积）无菌盐水中，以达到工作浓度1.0×10⁷ CFU/mL。实验单元随机分为两组：45盆接收到稀释后的TY15悬浮液（当重力监测确认土壤含水量达到20%–25%时进行灌溉），每盆提供1.0×10⁹ CFU（相当于8.3×10⁸ CFU/千克干土壤）；而45盆对照组则接收到等量的无菌盐水。两组均接受相同的灌溉制度。
在处理后的微生物群落分析中，从Qilin North Farm的种植地块无菌采集大豆根际土壤-根复合体。样本分为两组：未处理的CK组和TY15处理组。通过空气干燥和机械过筛（2毫米筛）对土壤样本进行物理化学特征分析。对于根际采样，根系在无菌PBS（pH 7.4）中涡旋处理50毫升，随后在40千赫兹超声波浴中处理30秒，并通过差速离心（8000×g，10分钟）将根际颗粒沉淀。内生菌群通过三阶段冲洗根系（无菌蒸馏水），然后进行超声波处理（50–60赫兹，30秒）和表面灭菌（80%乙醇浸泡2分钟，随后用PBS中和）。所有样本在−80°C下进行基因组DNA提取，使用磁珠基土壤DNA提取试剂盒。核苷酸完整性通过1.0%琼脂糖凝胶电泳（100伏，30分钟）验证，样品显示清晰的基因组条带且光谱浓度>10纳克/微升（260/280纳米吸光度比值1.8–2.0）后，进行后续分析。
对细菌群落的多样性进行了分析，采用标准的PCR条件（初始变性：95°C/5分钟；35个循环：95°C/50秒，56°C/50秒，72°C/1分钟；最终延伸：72°C/5分钟）扩增细菌16S rRNA基因的高变区V3–V4。扩增产物通过1.8%琼脂糖凝胶电泳（100伏，30分钟）进行验证，随后进行配对端测序。原始读数基于样本特定的条形码进行去复用，然后通过重叠共识算法进行序列合并。处理后的序列在97%核苷酸相似度阈值下进行聚类，生成操作分类单元（OTUs），并使用参考数据库筛选去除叶绿体和线粒体序列。OTU的分类通过BLASTn比对EzBioCloud的16S rRNA参考数据库完成。随后，使用标准化的计算流程进行多序列比对，包括VSEARCH（聚类）、USEARCH（奇异性检测）和QIIME（α/β多样性指标）。
对细菌群落的代谢功能进行预测，采用整合的生物信息学流程：PICRUSt用于酶预测，FAPROTAX用于生物地球化学过程注释，均参考KEGG通路分类。α多样性通过Shannon、Chao1、Simpson和Ace指数进行量化，以反映物种丰富度和均匀度。使用SPSS软件进行非参数Kruskal-Wallis检验（相似度阈值为97%），对不同处理下的土壤样本α多样性指标进行分析。β多样性分析采用加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA），揭示了实验组与对照组之间的显著差异。通过多方法排序（PCoA、UPGMA聚类和非度量多维尺度分析，NMDS压力<0.2）解析β多样性模式。多变量群落变异通过主成分分析（PCA）进一步分解。计算流程在R版本4.2.2中使用phyloseq进行数据结构化，使用ggplot2进行可视化。微生物群落的来源归因通过贝叶斯SourceTracker算法（Gibbs采样，1000次迭代）实现。这一整合分析框架使我们能够系统地探讨根际微生物群落的结构-功能关系，同时通过标准化计算可重复性控制保持分析严谨性。
高通量测序服务由Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd.（上海，中国）使用Illumina NovaSeq 6000平台（2×250 bp配对端测序）进行。所有分析，包括文库构建、测序和初始生物信息学处理（去复用、质量过滤和OTU聚类），均由服务提供商根据标准化协议进行。
统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验（P<0.05）进行，使用SPSS 26.0（IBM，美国）。这一统计方法应用于所有定量比较，包括植物生长参数（茎长/根长、生物量、叶面积）、生理指数（磷/钾溶解能力、吲哚-3-乙酸生产、酶活性）以及α多样性指标（Shannon、Chao1、Simpson和Ace指数）和关键微生物类群的相对丰度。
在实验中，从大豆根际中分离出193株细菌，并进行纯化。这些菌株在LB、PDA和YMA培养基上的分离数量分别为64、59和70，分别占总分离菌株的31.16%、30.57%和36.27%。使用DNA作为模板进行PCR指纹图谱聚类分析，将具有相同条带大小、数量和亮度的菌株归为同一簇，共形成19个细菌簇。每簇中选择一株代表菌株，具体细节见表S2。这些代表菌株被选用于进一步实验。代表菌株的分组和每组的代表菌株详情见表1。
表1展示了代表性大豆根际细菌菌株的16S rRNA基因序列相似性。菌株CL2与Priestia megaterium NBRC 15308T的序列相似度为99.79%；菌株CL5与Bacillus altitudinis 41KF2bT的相似度为100.00%；菌株CL6与Bacillus salipaludis WN066T的相似度为99.88%；菌株CL7与Priestia aryabhattai B8W22T的相似度为100.00%；菌株CL9与Bacillus tequilensis KCTC 13622T的相似度为99.89%；菌株CL10与Bacillus anthracis ATCC 14578T的相似度为99.39%；菌株CL24与Bacillus cereus ATCC 14579T的相似度为100.00%；菌株CP1与Bacillus subtilis NCIB 3610T的相似度为99.90%；菌株CP4与Shigella flexneri ATCC 29903T的相似度为99.89%；菌株CP7与Bacillus velezensis CR-502T的相似度为100.00%；菌株CP20与Leuconostoc mesenteroides subsp. Jonggajibkimchii DRC1506T的相似度为99.59%；菌株CY5与Paenibacillus wooponensis WPCB018T的相似度为99.37%；菌株CY31与Weizmannia ginsengihumi Gsoil 114T的相似度为100.00%；菌株TY10与Bacillus wiedmannii FSL W8-0169T的相似度为100.00%；菌株TY15与Rhizobium subbaraonis JC85T的相似度为99.15%；菌株TP1与Bacillus rugosus SPB7T的相似度为99.70%；菌株TP5与Bacillus siamensis KCTC 13613T的相似度为99.80%；菌株VL15与Bacillus licheniformis ATCC 14580T的相似度为99.55%；菌株VP12与Bacillus zhangzhouensis DW5-4T的相似度为99.78%。通过16S rRNA基因的PCR和测序，将清洁序列与NCBI数据库在EzBioCloud中进行比对，以识别具有相似序列的菌株。表1中显示了具有最高相似度的菌株。
基于16S rRNA的系统发育分析揭示了代表性菌株之间的显著多样性，其序列与模式菌株的相似度在99%至100%之间。菌株CL7（簇IV）与Priestia aryabhattai模式菌株B8W22T的序列相似度为100%；菌株TY15（分类XV）与Rhizobium subbaraonis参考菌株JC85T的相似度为99.15%。采用邻接法（bootstrap=1000次重复）进行的系统发育重建揭示了19株代表性根际细菌菌株的进化关系。这些分离物与它们的最近亲形成单系分支，其中芽孢杆菌占优势（63.2%的普遍存在率，12/19株），随后是Priestia（10.5%，2/19株），而其余的属（如Paenibacillus、Rhizobium和Leuconostoc）则仅出现一次。
生理和生化测试结果显示，大多数菌株对过氧化氢酶和氨的产生呈阳性。此外，大多数菌株能够还原硝酸盐（见表S1）。菌株TY15在血琼脂板上被进一步确认为非溶血性（γ-溶血），表明其在农业应用中的低病原性风险。这些发现表明，这些根际细菌可能有助于保护植物免受非生物和营养胁迫的影响。
根际细菌对病原菌的拮抗作用结果表明，TY15对香蕉枯萎病的病原菌尖孢镰刀菌表现出抑制作用（见图1A）；CP4、CP7和TP1对辣椒细菌性枯萎病的病原菌假单胞菌也有显著的抑制作用（见图1B）；TP5和TY15对水稻叶鞘腐烂病的病原菌立枯丝核菌表现出拮抗作用（见图1C）。图1展示了不同病原菌在对照组与菌株处理组之间的抑制效果。在图1A中，对照组与TY15组的菌落生长呈现出不规则的模式；在图1B中，对照组与CP4、CP7、TP1组的菌落形态表现出多样性；在图1C中，对照组与TP5、TY15组的菌落生长显示出不同的模式。
在植物生长促进能力测试中，不同菌株的磷、钾溶解能力以及IAA含量被测量。此外，蛋白酶和纤维素酶的生产通过琼脂板和试管进行定性检测（见表S2和S3）。定量分析显示，在七个活跃菌株（CL9、CP7、CP20、CY31、TP5、VL15和VP12）中，菌株CP20是最强的磷溶解菌，其溶解量为121.34毫克/升。在八个菌株（CL6、CL7、CP1、CP4、CP7、CP20、CY5和TY15）中，菌株CP1表现出最高的钾溶解能力，其溶解量为115.39毫克/升。蛋白酶活性在18个菌株中普遍存在，而17个菌株表现出纤维素酶活性。淀粉酶合成仅限于六个菌株（CL7、CL24、CP7、TP1、TY10和VP12）。值得注意的是，铁载体分泌在六个菌株（TY10、VL15、CP7、TP1、CL24和CP20）中被观察到。补充的酶学分析（见表S4）通过定性琼脂试验检测到CP7、CP20、CY31和TY15的几丁质酶活性，以及CP4、CP7、CY5、CY31和TY15的ACC脱氨酶活性。
主成分分析（PCA）揭示了细菌分离物在多维空间中的紧密聚类模式，显示了酶功能（IAA生物合成和磷溶解）与植物生长促进指数之间的显著协变关系。数据点在主成分轴上的近距离（欧几里得距离<0.85）表明微生物代谢特征与植物益处之间存在强正相关（皮尔逊r>0.72，P<0.01）（见图2）。图2展示了不同酶和植物生长特征之间的PCA结果。
在实验中，根据微生物群落的多样性分析，TY15菌株因其在生长促进方面的最佳表现被选为进一步实验的对象。通过水平微生物群落分析（见图S6），TY15处理组中假单胞菌门的比例显著增加，表明其在磷溶解和植物生长促进中的重要作用。这种增加伴随着寡营养菌群如酸杆菌门和Gemmatimonadota的减少，暗示TY15介导的养分溶解降低了寡营养菌对稀缺资源的竞争。值得注意的是，TY15处理组中放线菌门和变形菌门的丰度增加，这两个门均参与有机物分解和复杂底物降解功能。相反，酸杆菌门和Gemmatimonadota的比例显著下降，这表明TY15处理可能通过改善根际养分条件抑制了寡营养菌群的增殖。此外，硝化菌门、疣微菌门和蓝菌门在两个处理组之间表现出波动差异。整体的群落重组表明TY15处理重塑了根际微生物代谢网络和生态平衡。
通过功能冗余分析，TY15重新编程了微生物网络，使其在抗逆性和资源利用效率方面得到增强。共现网络显示，TY15处理组中的芽孢杆菌和根瘤菌属之间的连接更密集（度中心性=38），表明它们在生态网络中形成了协同作用，稳定了生态系统功能。这与对照组中病原菌相关的菌群（如尖孢镰刀菌和立枯丝核菌）在对照组中表现出更高的连接性形成对比。观察到的病原菌丰度减少支持了“优先效应”假说，即有益微生物的早期定殖通过资源竞争和抗菌代谢物的产生抑制了病原菌。
与之前的研究相比，TY15介导的群落重组表现出不同的特性。与Breitkreuz等人（18）报道的单菌株接种相比，TY15在接种后30天内持续表现出拮抗活性。这种耐久性与在氮限制条件下*nif*A和*nod*D基因的上调有关，使共生固氮效率比商业接种剂提高了18%。这些发现突显了TY15重塑根际微生物群落以增强作物抗逆性的独特能力。观察到的群落变化为设计合成微生物群落提供了可操作的见解，该群落能够协同促进植物生长和抑制病原菌，从而在农业生态系统中提高作物的抗逆性。
TY15对大豆生长的促进作用与其多机制协同效应有关，包括直接的养分溶解和间接的根际微生物群落调节。与对照组相比，TY15处理显著增加了茎和根的长度，这可能归因于其强大的磷和钾溶解能力（最高达到121.34毫克/升）。此外，TY15对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌表现出显著的拮抗作用，这可能通过竞争定殖和抗菌代谢物的产生实现。高通量测序进一步揭示了TY15应用显著改变了根际微生物群落结构，增加了有益菌属如芽孢杆菌和根瘤菌的相对丰度，这些菌属协同提高了养分的可利用性和病原菌的抑制效果。这些发现突显了单菌株生物肥料如TY15在提高大豆抗逆性和减少对化学投入的潜力。未来需要进行为期五年的田间研究，以验证TY15在不同土壤类型和环境条件下的长期效果。
本研究通过分离和鉴定大豆根际的微生物，揭示了*Rhizobium subbaraonis* TY15在促进大豆生长和增强抗病性方面的作用。通过生理实验，发现TY15处理显著增加了大豆的地上部和地下部长度，这归因于其强大的磷和钾溶解能力。此外，TY15对病原菌表现出强烈的拮抗作用，可能通过竞争定殖和抗菌代谢物的产生实现。高通量测序进一步表明，TY15的应用显著改变了根际微生物群落结构，增加了有益菌属如芽孢杆菌和根瘤菌的丰度，这些菌属协同促进了养分的可利用性和病原菌的抑制。这些发现强调了单菌株生物肥料如TY15在提高大豆抗逆性和减少对化学投入的潜力。未来需要进行为期五年的田间研究，以验证TY15在不同土壤类型和环境条件下的长期效果。
在本研究中，通过筛选和功能分析，发现*Rhizobium subbaraonis* TY15显著通过多种机制增强大豆的生长和抗病性。生理实验显示，TY15处理显著增加了大豆的地上部和地下部长度，这可能归因于其强大的磷和钾溶解能力。此外，TY15对病原菌表现出强烈的拮抗作用，这可能通过竞争定殖和抗菌代谢物的产生实现。高通量测序进一步揭示了TY15应用显著改变了根际微生物群落结构，增加了有益菌属如芽孢杆菌和根瘤菌的丰度，这些菌属协同促进了养分的可利用性和病原菌的抑制。这些发现强调了单菌株生物肥料如TY15在提高大豆抗逆性和减少对化学投入的潜力。未来需要进行为期五年的田间研究，以验证TY15在不同土壤类型和环境条件下的长期效果。
打赏
