植物作为固着生物，必须不断监测其环境并调整其生长和发育以维持稳态并优化适应性。除了病原微生物，植物还面临食草动物的攻击和环境因素引起的机械损伤。这些物理性损伤通常表现为细胞膜和植物细胞壁的完整性破坏。为了恢复，植物会激活适当的防御通路，以阻止机会性病原体入侵，同时启动修复过程，再生健康细胞、组织甚至新器官以替代受损或丢失的部分。在过去20年中，关于植物在各种物理伤害下诱导的复杂通路的研究取得了稳步进展。这些研究主要集中在两个方面：一是理解驱动再生和伤口修复的细胞和分子事件；二是探讨如何通过感知两种类型损伤相关分子模式（DAMPs），即由植物自身成分生成并通过高度保守的信号通路，如一系列受体样激酶，激活基础免疫通路（Bartels et al., 2013; Ge et al., 2022; Yamada et al., 2016）。从受损细胞中，一些常见的细胞成分如核苷酸、细胞壁碎片和氨基酸（称为cDAMPs）会泄漏到植物细胞壁与质膜之间的胞外空间，并作为配体与特定的跨膜受体激酶结合，从而激活局部和系统性的免疫信号（Ge et al., 2022）。此外，称为植物细胞因子（phytocytokines）的可诱导DAMPs可以在细胞损伤感知后被产生，以激活特定的次级信号，进而增强基础免疫反应并提高对多种非生物胁迫的耐受性（Bartels & Boller, 2015; Nakaminami et al., 2018; Rhodes et al., 2021）。
越来越多的研究表明，这些植物细胞因子需要特定的蛋白酶（如半胱天冬酶MCs或类亚基酶subtilases）进行裂解，才能转化为成熟的肽。尽管钙离子动员和活性氧（ROS）信号是已知的早期细胞响应机制（Hernandez-Coronado et al., 2022），但如何协调由iDAMPs触发的免疫反应与组织再生过程之间的关系仍不清楚（Hoermayer & Friml, 2019）。这一问题尤为重要，因为基础免疫反应的强诱导已被证明会对抗植物的生长和发育（Hernandez-Coronado et al., 2022; Huot et al., 2014; Major & Campos, 2022）。最近在理解调控这些蛋白酶（特别是保守的拟南芥AtMC9和AtMC4）的精确机制方面取得了进展，这些蛋白酶在氧化应激下可生成细胞死亡诱导肽Grim Reaper（GRIp），在伤口下可生成植物细胞因子Pep1（Hander et al., 2019; Wrzaczek et al., 2015）。这促使我们研究这些严格调控的蛋白酶如何帮助协调植物受伤时的全局转录景观。本研究通过比较转录组学，分析了缺乏AtMC4或AtMC9基因的拟南芥基因型，以揭示它们在伤口反应中的作用。我们发现，AtMC4在受伤后是启动强烈转录反应的关键，包括关键的发育基因WOX5（Pi et al., 2015）。
在拟南芥中，有六种类型II的半胱天冬酶（MC）基因编码参与胁迫反应和发育的酶。AtMC4和AtMC9是持续表达的成员，而AtMC5-8则在常规条件下表达较低（Lam & Zhang, 2012; Tsiatsiani et al., 2013）。这些MCs在合成时为无活性的前体，需要在适当条件下通过自催化裂解在p20和p10结构域之间的连接区进行激活（Lam & Zhang, 2012）。AtMC4至AtMC8需要毫摩尔浓度的钙离子以实现最佳酶活，而AtMC9则仅在酸性pH条件下被激活（Fortin & Lam, 2018; Vercammen et al., 2004）。AtMC4在响应生物性细菌病原体时增强免疫并诱导细胞死亡（Watanabe & Lam, 2011a），而AtMC9则通过死后清除死细胞内容物促进木质部形成（Bollhöner et al., 2013）。已知AtMC4和AtMC9都参与了GRIp和Pep1等植物细胞因子的成熟，后者是参与病原体和食草动物抗性的八个前体肽之一（Bartels et al., 2013; Hander et al., 2019; Wrzaczek et al., 2015）。一项研究将AtMC4与Pep1的裂解联系起来，显示虽然在叶组织中AtMC4的裂解能力在atmc4-1背景下丧失，但在根组织中仍保持活性（Hander et al., 2019）。这表明，除了AtMC4，还有另一种类型II的MC可能在根组织中处理Pep1。
为了验证这一预测，我们比较了重组Propep3融合蛋白在重组AtMC4和AtMC9的裂解情况（图1c）。如前所述（Hander et al., 2019），AtMC4在存在钙离子的情况下无法处理Propep3-GST融合蛋白，而AtMC9则可以在pH 5.5条件下处理该融合蛋白，但在pH 7.5条件下无法处理（图1c）。此外，AtMC9的活性位点半胱氨酸突变C147G会使其无法裂解Propep3-GST，而AtMC9在pH 7.5条件下无法裂解Propep3-GST（图S1a,c; 图1c）。除了使用抗GST血清，我们还通过抗T7血清确认了重组Propep3-GST融合蛋白的解读（图S1c）。综上所述，我们的数据表明AtMC4和AtMC9在底物特异性方面有重叠和不同的特点。之前的一些研究中观察到的矛盾结果（Shen et al., 2019）可能是由于在使用原生质体制备方法时，可能创建了一个受伤细胞的背景，这可能会干扰结果的解释。此外，当与Propep融合基因和各种半胱天冬酶的表达载体共转化时，其他内源性MC编码基因或植物蛋白酶的激活也可能进一步影响数据的解读。
为了进一步探索AtMC4和AtMC9在伤口反应中的作用，我们使用比较转录组学方法研究了AtMC4和AtMC9缺失对拟南芥叶片中全局伤口反应的影响。我们采用了一种叶片受伤协议（Hander et al., 2019; 图S2），以观察不同基因型的植物在受伤后的反应。此前的研究表明，AtMC4影响受伤后防御基因的表达（Hander et al., 2019），而外源性施用Pep1会改变转录组，表现出与其它MAMPs（微生物相关分子模式）相似的特征（Bjornson et al., 2021），但AtMC4和AtMC9的更广泛作用仍不清楚。在本研究中，我们分析了拟南芥叶片在受伤后4小时的转录组，这一时间点在多个涉及拟南芥叶片组织的研究中与初始转录激活的高峰相关（Hander et al., 2019; Ikeuchi et al., 2017）。
通过比较野生型（WT）、atmc4-1和atmc9-1突变体，我们发现AtMC4的缺失将伤口诱导的差异表达基因（DEGs）减少了超过97%，而AtMC9的缺失仅使DEGs减少20%（图2）。在显著的DEGs中（Log2 FC >2），有341个基因专门依赖于AtMC4，而只有3个基因单独依赖于AtMC9。此外，有233个DEGs同时依赖于AtMC4和AtMC9，因为它们在两个突变体中均未被诱导。有趣的是，有118个DEGs仅在atmc9-1背景下被诱导，而在WT或atmc4-1植物中未被激活，这表明AtMC9在WT植物中抑制了这些基因的表达。我们的分析还发现，在WT植物中，有75个DEGs被伤口显著抑制（Log2 FC <−2），其中19个需要AtMC4，而56个需要AtMC4和AtMC9（图S3）。
通过基因本体（GO）分析，高度诱导的DEGs（Log2 FC >3）被分为AtMC4依赖型（231个基因）和AtMC4/9共依赖型（141个基因）两个组。AtMC4依赖型基因在与胁迫反应、非生物胁迫、防御、伤口、植物激素、代谢和发育相关的通路中富集，而AtMC4/9共依赖型基因则表现出类似的富集，但与发育相关的基因较少，主要与衰老相关（表S2和S3）。这些发现表明，AtMC4是植物在受伤后启动转录变化的主要驱动因素，激活防御和发育通路。而AtMC9则起到辅助作用，在WT植物中帮助AtMC4激活额外的防御和衰老相关基因，同时抑制其他基因。这些结果表明，这两种MC共同作用，以平衡受伤组织中的应激反应、免疫和生长之间的关系。
植物细胞因子Pep1在激活基础免疫方面起着重要作用（Bartels et al., 2013; Ge et al., 2022; Yamada et al., 2016），并且AtMC4通过裂解Propep1生成Pep1（Hander et al., 2019）。我们试图确定在AtMC4依赖型DEGs中，有多少基因依赖于Pep1的成熟。我们假设，那些仅依赖于Pep1信号并通过已知的PEPR1/2和BAK1受体（Schulze et al., 2010; Yamada et al., 2016）激活的基因，当用合成Pep1处理时，应表现出对AtMC4缺失的上位性。为此，我们分析了在WT、atmc4-1和atmc9-1基因型中，分别用水、0.1 μM合成Pep1或0.1 μM重组Propep1处理后，再进行力ps压缩性损伤以激活内源性MCs的转录组。我们发现，单独用水浸润也能诱导一个类似受伤的转录组反应，尽管与力ps压缩性损伤有一些差异（图3a; 图S4）。在427个高度显著的DEGs中，85%需要AtMC4（63%专门依赖，22%与AtMC9共依赖）。Pep1浸润将DEGs增加到978个（Log2 FC >3），其中52%（510个）与MCs无关。然而，一些Pep1诱导的DEGs仍然需要AtMC4、AtMC9或两者（图3b）。值得注意的是，在WT植物中被AtMC4抑制的一组Pep1诱导基因在atmc4-1基因型中被揭示出来。Propep1浸润与力ps压缩性损伤结合后，诱导的DEGs数量比单独用水浸润增加了三倍，其中87%和58%的DEGs分别在atmc4-1和atmc9-1中被抑制（图3c），这证实了MC依赖的Propep1裂解过程。
我们比较了Pep1响应（Pep1+）和Pep1无关（Pep1−）的AtMC4调控DEGs之间的基因类别，以理解它们在受伤反应中的作用。我们选择了六个类别进行针对性分析：（1）植物细胞因子和分泌肽相关功能，（2）转录因子（TFs），（3）细胞壁修饰功能，（4）生长素相关功能，（5）其他植物激素如茉莉酸（JA）、赤霉素（GA）和乙烯，以及（6）防御相关。在Pep1+组中，128个DEGs中有46个符合这六个类别，其中转录因子（21个）和防御相关基因（Huot et al., 2014）占主导地位（表1）。很少有DEGs与生长相关功能如植物激素或细胞壁修饰相关。两个Pep1+ DEGs在4小时内被诱导超过360倍，分别是CEP14和PROSCOOP7。CEPs是分泌肽，可以影响根系发育以及非生物胁迫反应（Liu et al., 2021; Roberts et al., 2013），而PROSCOOPs是近年来发现的植物细胞因子，可以介导微生物和食草动物相关的防御（Rhodes et al., 2021）。这一组中的转录因子包括5个WRKYs、6个ERFs（乙烯反应因子）和其他类别。WRKYs和ERFs是大型的植物特异性转录因子家族，已知在应激反应和防御中起重要作用（表S9）。在11个防御相关基因中，前三个DEGs是IOS1（一个LRR受体样激酶）、NHL10（NDR1/HIN1样蛋白），后者已知在Pep1和其他免疫诱导诱饵的激活下被强烈诱导，以及一个内切几丁质酶（At2G43620），该酶可能提供抗真菌活性。这些基因的表达水平被观察到达到8000到700倍的诱导。
对于Pep1−组，244个DEGs中有91个符合这六个类别，其中更多与植物细胞因子（8个DEGs）和细胞壁修饰（20个DEGs）相关，而Pep1+组中的DEGs只有四个（表1）。植物细胞因子DEGs包括PROSCOOP5、PROSCOOP8、肽植物硫代糖肽2（PSK2）、IDA样7（IDL7）和一个Stig1家族肽。此外，一个类亚基酶（SBT3.3），可能处理PROSCOOPs（Yang et al., 2023），以及AtMC7（一个类型II的MC，>70倍诱导），该MC可能处理其他Propeps（图1a），也属于这一组。IDL7是一个分泌肽，已知在通过肽诱饵激活基础免疫时被迅速诱导，可能有助于抑制与应激相关的ROS信号（Vie et al., 2017）。一个DEG编码一个Stig1家族的半胱氨酸丰富的肽，包括GRIp肽，也被高度诱导。20个细胞壁功能相关的DEGs（例如编码伸展蛋白和果胶酯酶的基因）表明它们可能在受伤组织中参与生长和组织重编程。
39个转录因子也构成了Pep1−组DEGs的主要类别，但其组成在特定的转录因子类别中与Pep1+组不同：Pep1+组中WRKY TFs减少，只有3个DEGs，而另一个植物特异性转录因子家族NAC类的TFs则从1个增加到7个（表S9）。NAC TFs是大型的植物特异性TFs家族，已知调控生长、分化和非生物胁迫反应（Olsen et al., 2005）。同样，ERF TFs增加到11个，包括ERF109、ERF114、ERF115和ERF113L，所有这些都参与了通过茉莉酸介导的伤口信号（Zhang et al., 2019），并且在对拟茎的受伤反应研究中被激活（Ikeuchi et al., 2017），同时对愈伤组织的形成也至关重要（表S9）。此外，观察到的WOX5基因表达水平变化表明，这些DEGs在组织再生中的重要性。总之，AtMC4调控的Pep1−组DEGs中转录因子的模式变化与伤口愈合和再生通路的协调一致。
在研究AtMC4和AtMC9对Pep1驱动的免疫转录组的影响时，我们比较了在WT、atmc4-1和atmc9-1背景下Pep1和flg22诱导的DEGs（图S8）。在WT中，这两种诱饵都诱导了约850个DEGs，其中538个是共同的，而330个是特定于每种诱饵的。在atmc4-1中，Pep1诱导的DEGs增加了近400个，这可能是由于AtMC4介导的抑制作用丧失，而flg22诱导的DEGs几乎没有变化。相比之下，在atmc9-1植物中，flg22诱导的DEGs增加了约400个基因，添加了205个共同和177个flg22特异性DEGs，而Pep1特异性DEGs减少了超过50%，这表明AtMC9对于其诱导是必要的（图S8c）。这表明AtMC9通过调节防御反应的强度，显著抑制了部分flg22响应的免疫基因（可能以减少生长抑制），从而帮助调控防御反应（Huot et al., 2014; Major & Campos, 2022）。
鉴于AtMC4在伤口反应转录组协调中的明确需求，我们预测atmc4-1植株在受损叶片中的组织再生会受到显著影响。我们使用之前描述的根系从叶片再生试验（Hernandez-Coronado et al., 2022），比较了不同遗传背景的拟南芥叶片在受伤部位再生根系的频率。我们发现，atmc4-1突变体叶片再生根系的频率显著下降，约为WT植物的一半（图5）。此外，atmc4-1植株表现出更高的红色色素水平，很可能是类黄酮，这可能表明其对伤口胁迫有更强的反应（图5; 图S11）。相比之下，atmc9-1背景下的叶片再生频率仅下降约20%，且统计学意义较低（图5），并且未观察到过量的类黄酮。重要的是，转基因株系#10-3在atmc4-1背景中恢复了这些突变表型（图5），这证实了AtMC4在伤口部位再生根系中的重要性。
考虑到AtMC4在协调叶片组织的伤口反应转录组中的关键作用，我们预测AtMC4和AtMC9之间可能存在功能冗余。为了测试这一假设，我们使用相同的表达载体构建了AtMC9的表达结构，并将其转化到atmc4-1突变体背景中。在多个独立转化株系中，我们选择了表达水平较高的转基因株系AtMC4pro::AtMC9，#10（图S12）进行进一步研究，以评估AtMC9能否恢复Pep1诱导的基因表达。尽管AtMC4和AtMC9在体外都能裂解Propep1，但它们的酶激活机制存在差异，AtMC4需要毫摩尔级的钙离子，而AtMC9仅在酸性pH条件下被激活，且与钙离子无关（Fortin & Lam, 2018; Vercammen et al., 2004）。此外，这两种MC还可能有其他不同的底物，如Propep3（如上所述）。因此，AtMC9的异位表达可以恢复Pep1诱导的基因表达，如ACS8、WRKY48和NHL10在atmc4-1背景中的表达，但无法恢复Pep1无关的基因WOX5的表达（图6）。有趣的是，尽管Pep1诱导的ACS8和NHL10在atmc9-1突变体中也被恢复，但WRKY48的激活并未恢复，这与观察到AtMC9在Pep1介导的防御信号中抑制WRKY48表达的发现一致（图4）。因此，AtMC9的异位表达可能在补偿AtMC4的Propep1裂解功能的同时，增加WRKY48的抑制。AtMC9无法恢复WOX5的伤口诱导表明，AtMC4在激活Pep1无关的、伤口响应的基因中具有独特的作用，并暗示了需要AtMC4特异性底物的隐秘信号。
在了解了AtMC4在协调伤口反应转录组中的关键作用后，我们预测atmc4-1突变体在受伤叶片中的组织再生会受到显著影响。我们使用了之前描述的根系从叶片再生试验（Hernandez-Coronado et al., 2022），比较了不同遗传背景的拟南芥叶片在受伤部位再生根系的频率。我们发现，atmc4-1突变体叶片再生根系的频率显著下降，约为WT植物的一半（图5）。此外，atmc4-1突变体表现出更高的红色色素水平，很可能是类黄酮，这可能表明其对伤口胁迫有更强的反应（图5; 图S11）。相比之下，atmc9-1背景下的叶片再生频率仅下降约20%，且统计学意义较低（图5），并且未观察到过量的类黄酮。重要的是，转基因株系#10-3在atmc4-1背景中恢复了这些突变表型（图5），这证实了AtMC4在伤口部位再生根系中的重要性。
研究还揭示了AtMC9在Pep1介导的基因激活中的抑制功能，有助于在DAMP反应中塑造防御相关的转录组景观。尽管许多应激相关信号通路已知共享相同的适配受体激酶并影响重叠的靶基因（Bjornson et al., 2021; Rhodes et al., 2021; Schulze et al., 2010; Yamada et al., 2016），但如何通过调节这些通路以产生不同的转录反应和表型结果仍不清楚。我们的结果表明，AtMC9在WT植物中通过抑制一些通常在基础免疫诱导（如通过MAMPs如flg22）下强烈表达的基因，从而帮助调节PEPR1/2-BAK1受体复合物下游的输出。AtMC4和AtMC9之间的合作对于激活防御和非生物胁迫相关的第二组基因至关重要，同时第一组基因依赖于AtMC4。这种共依赖可能源于它们共享相同的蛋白酶底物，如Propep1（图1a; Liu et al., 2025; Shen et al., 2019），尽管它们的激活机制不同，AtMC4需要细胞内钙离子的毫摩尔级浓度，而AtMC9则需要pH 5.6或更低的酸性条件，且与钙离子无关（Fortin & Lam, 2018; Vercammen et al., 2004）。此外，这两种MC还可能有其他不同的靶底物，如Propep3。
研究还揭示了AtMC9在Pep1介导的基因激活中的抑制功能，有助于在DAMP反应中塑造防御相关的转录组景观。尽管许多应激相关信号通路已知共享相同的适配受体激酶并影响重叠的靶基因（Bjornson et al., 2021; Rhodes et al., 2021; Schulze et al., 2010; Yamada et al., 2016），但如何通过调节这些通路以产生不同的转录反应和表型结果仍不清楚。我们的结果表明，AtMC9在WT植物中通过抑制一些通常在基础免疫诱导（如通过MAMPs如flg22）下强烈表达的基因，从而帮助调节PEPR1/2-BAK1受体复合物下游的输出。AtMC4和AtMC9之间的合作对于激活防御和非生物胁迫相关的第二组基因至关重要，同时第一组基因依赖于AtMC4。这种共依赖可能源于它们共享相同的蛋白酶底物，如Propep1（图1a; Liu et al., 2025; Shen et al., 2019），尽管它们的激活机制不同，AtMC4需要细胞内钙离子的毫摩尔级浓度，而AtMC9则需要pH 5.6或更低的酸性条件，且与钙离子无关（Fortin & Lam, 2018; Vercammen et al., 2004）。此外，这两种MC还可能有其他不同的靶底物，如Propep3。
在研究AtMC4和AtMC9的蛋白酶功能时，我们采用了基于蛋白质序列的分析方法，以快速筛选可能被类型II MCs裂解的潜在底物。我们使用了AlphaFold2（Jumper et al., 2021）这一结构预测算法，系统地筛选了来自八个AtPropep的蛋白质序列，以确定它们与六个类型II MC蛋白质的相互作用。我们应用了三个过滤条件来识别每个类型II MC的潜在底物：（1）使用PHENIX计算的碰撞分数，以排除与相应MC碰撞超过50的候选者；（2）使用CCP4程序PISA计算与特定MC的界面面积，并设定500 Ų的阈值以排除松散结合的蛋白质；（3）设定催化残基C139硫醇基团（SG）在AtMC4或其它MCs中的等效活性位点与候选Propep底物的最近原子之间的距离应小于4.5 Å。此外，在我们的分析流程中，还优先考虑了活性位点半胱氨酸SG与底物中的精氨酸/赖氨酸羰基氧之间的较短距离。为了确保AtMC4和其它五种类型II MCs的催化位点不会被其各自的连接区阻塞，在结构预测和Propep底物对接前删除了这部分蛋白质序列。更多细节请参见补充信息文件。
