三级淋巴结构空间分布通过CXCL13-ACKR1轴调控胃癌免疫微环境及免疫治疗预后的单细胞与空间转录组学研究

本研究针对胃癌免疫治疗响应率低的临床挑战，通过整合单细胞RNA测序和空间转录组学技术，系统解析了不同空间分布模式的三级淋巴结构(TLS)对肿瘤免疫微环境的调控机制。研究发现肿瘤内TLS富含CXCL13+ T细胞、CXCR5+生发中心B细胞、LAMP3+树突状细胞和SELP+ACKR1+高内皮静脉细胞，并揭示了CXCL13-ACKR1信号轴通过上调VCAM1/ICAM1促进T细胞招募的新机制。基于此开发的单细胞空间TLS特征谱可有效预测免疫检查点抑制剂治疗反应，为胃癌精准免疫治疗提供了新策略。

在当今肿瘤免疫治疗时代，胃癌治疗领域正面临着一个严峻的挑战：尽管免疫检查点抑制剂(ICIs)为晚期胃癌患者带来了新的希望，但仍有25%-40%的患者对一线免疫治疗联合化疗方案无响应。如何在进行治疗前精准筛选潜在获益人群，避免无效治疗带来的毒副反应和经济负担，成为胃癌免疫治疗领域亟待解决的关键科学问题。

传统生物标志物如微卫星不稳定性(MSI-H)、程序性死亡配体1(PD-L1)表达评分(CPS)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)状态和肿瘤突变负荷(TMB)虽已应用于临床，但由于胃癌的高度异质性，这些标志物的预测价值有限。近年来，三级淋巴结构(TLS)作为肿瘤微环境(TME)中的重要免疫枢纽，其与免疫治疗疗效的相关性受到广泛关注。然而令人困惑的是，在不同癌种中TLS显示出截然相反的预后价值——在肝内胆管癌中，TLS甚至与不良预后相关。这种矛盾现象提示我们，TLS的功能可能高度依赖于其在肿瘤中的空间分布位置。

在这项发表于《Nature Communications》的重要研究中，Yanchun Wang、Guangyu Zhang等研究人员联合多个团队，首次从单细胞分辨率和空间维度系统揭示了TLS空间分布模式如何塑造胃癌免疫微环境，并创新性地提出了可预测免疫治疗疗效的生物标志物。研究人员通过对110例胃癌患者组织病理学分析，根据TLS空间分布特征将胃癌分为三种亚型：肿瘤内TLS(iTLS-GC)、瘤周TLS(pTLS-GC)和无TLS(dTLS-GC)胃癌。生存分析显示，iTLS-GC患者具有最长的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)，且对免疫治疗的响应率最高。

为深入解析不同TLS状态下的肿瘤微环境特征，研究团队对30例胃癌标本（25例进行单细胞RNA测序，5例进行空间转录组测序）进行了多组学分析。单细胞转录组数据共捕获88,100个高质量细胞，鉴定出11种主要细胞类型。空间转录组分析通过整合5例胃癌样本（2例iTLS-GC、2例pTLS-GC和1例dTLS-GC）的13个空间聚类，发现ST cluster 4高表达B细胞标志物MS4A1、CD37和TLS相关细胞因子CCL19、CXCL13、CXCR4，且主要分布于iTLS-GC和pTLS-GC样本。

关键技术方法方面，研究整合了单细胞RNA测序(10X Genomics平台)和空间转录组学(10X Visium技术)，对25例新鲜胃癌组织（6例dTLS-GC、9例pTLS-GC、10例iTLS-GC）进行了解析。通过免疫组化、多重免疫荧光染色验证关键发现，并利用ACKR1过表达内皮细胞模型进行CXCL13-ACKR1信号轴功能验证。39例接受免疫治疗的胃癌患者队列用于生物标志物验证。

T细胞和NK细胞的单细胞与空间转录组特征

研究人员通过对T细胞和NK细胞进行无监督聚类，鉴定出2个NK细胞亚群、5个CD8⁺ T细胞亚群和4个CD4⁺ T细胞亚群。其中，CXCL13⁺CD8⁺、GZMB⁺CD8⁺和CXCL13⁺CD4⁺ T细胞亚群高表达免疫细胞归巢信号基因CXCL13、ITGAE（编码CD103）和细胞毒性效应基因GZMB，这些特征与免疫治疗良好预后相关。细胞组成分析显示，iTLS-GC和pTLS-GC中CXCL13⁺CD8⁺和CXCL13⁺CD4⁺ T细胞显著富集，而dTLS-GC中富含naive IL7R⁺CD4⁺ T细胞。

B细胞亚群的单细胞与空间转录组特征

B细胞亚群分析鉴定出生发中心B细胞(gc_B)、增殖性gc_B(gc_B_MKI67)、naive B细胞(naive_B)、记忆B细胞(memory_B)以及4个浆细胞亚群(IGA_B、IGG_B、IGM_B、IGJ_B)。iTLS-GC中gc_B_MKI67、gc_B和IGA_B显著富集，而pTLS-GC中IGG_B和IGM_B更丰富。功能富集分析显示gc_B_MKI67和gc_B高表达PD-1和CTLA-4免疫检查点通路。细胞间相互作用分析发现CXCL13⁺ T细胞通过CXCL13-CXCR5配体-受体对与gc_B_MKI67和gc_B相互作用。

髓系细胞亚群的单细胞与空间转录组特征

髓系细胞分为11个亚群：肥大细胞(Mast)、中性粒细胞(Neu)、单核细胞(Mono)以及4个肿瘤相关巨噬细胞(TAM)亚群(CCL18⁺ TAM、SPP1⁺ TAM、FOLR2⁺ TAM、C1QC⁺ TAM)和4个树突状细胞(DC)亚群(CLEC10A⁺ DC、CD1C⁺ DC、LAMP3⁺ DC、LILRA4⁺ DC)。iTLS-GC中LAMP3⁺ DC显著富集，基因集变异分析(GSVA)显示其高表达M1标志物、迁移和活化评分。相互作用分析表明LAMP3⁺ DC通过PDCD1-CD274(PD-1-PD-L1)、CXCL16-CXCR6、CCL19-CCR7、CD80-CD28和LGALS9-HAVCR2等配体-受体对与T细胞相互作用。

基质细胞亚群的单细胞与空间转录组特征

内皮细胞分为6个亚群，其中Endo1高表达ACKR1、P-选择素(SELP)和E-选择素(SELE)，被注释为高内皮静脉(HEV)；Endo6高表达LYVE1、PDPN和CCL21。iTLS-GC中Endo1/HEV细胞显著富集，基因本体(GO)富集分析显示其参与白细胞迁移、黏附和外渗等免疫细胞招募过程。多重免疫荧光染色证实HEV与CXCL13⁺CD8⁺ T细胞在iTLS-GC肿瘤内区域和pTLS-GC瘤周区域共定位。相互作用分析发现Endo1/HEV通过ACKR1-CXCL13/CCL5/CCL17、SELP/SELE-SELPG、NECTIN2-TIGIT和LGALS9-HAVCR2通路与免疫细胞频繁相互作用。

功能实验证实，CXCL13刺激可通过ACKR1-CXCL13轴显著上调VCAM1和ICAM1表达，促进T细胞迁移。Transwell实验显示，经CXCL13处理的ACKR1过表达内皮细胞能招募更多T细胞，验证了CXCL13-ACKR1信号轴在T细胞招募中的功能作用。

独特的TLS特征谱预示免疫治疗响应

基于上述发现，研究团队开发了单细胞空间TLS(ssTLS)特征谱，不仅包含传统TLS标志基因(CD3D、CD3E、CD19、MS4A1、CD79A)，还整合了免疫相关特征基因(CXCL13、CXCR5、CXCL16、CCL19、CCL22、ACKR1、SELE)。该特征谱在空间分布上与TLS区域高度一致，且在抗PD-1治疗响应患者中显著高表达。生存分析显示，ssTLS特征谱高分患者具有更长的PFS和OS，受试者工作特征曲线(ROC)分析显示其预测免疫治疗响应的曲线下面积(AUC)达0.795。

本研究通过多组学整合分析，首次从单细胞分辨率和空间维度系统揭示了TLS空间分布模式对胃癌免疫微环境的塑造作用，提出了CXCL13⁺ T细胞通过CXCL13-ACKR1轴被HEV招募，进而通过CXCL13-CXCR5通路吸引CXCR5⁺生发中心B细胞，最终促进TLS形成的细胞分子机制。所开发的ssTLS特征谱为胃癌免疫治疗疗效预测提供了新型生物标志物，为个体化治疗策略制定奠定了科学基础。

研究的局限性包括样本量相对有限、10X Visium空间转录组技术分辨率不足以在单细胞水平解析TLS异质性、以及缺乏体内功能验证模型。未来研究可借助更先进的空间转录组技术重建TLS三维结构，并通过基因编辑模型深入探讨已发现信号通路在TLS形成中的机制贡献和治疗意义。