氧化应激是一种重要的生物现象，由生物体内氧化剂过度产生与抗氧化剂消耗失衡引起，与细胞功能障碍、组织损伤及多种疾病过程密切相关[1]、[2]、[3]、[4]。活性氧（ROS）和活性氮物种（RNS）是具有氧化还原活性的关键氧化剂，它们在各种生物和病理过程中由氧的氧化和代谢产生，可作为判断氧化应激的生物标志物[5]、[6]、[7]。其中，超氧阴离子（O2•⁻）主要通过线粒体电子传递链和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的一电子还原生成，随后通过超氧化物歧化酶（SOD）转化为过氧化氢（H2O2）[8]、[9]。超氧阴离子（O2•⁻）是高活性过氧亚硝酸盐（ONOO-的前体，可与内源性一氧化氮（NO）反应生成ONOO⁻[10]。此外，在Cl⁻存在下，过氧化氢（H2O2）可通过髓过氧化物酶（MPO）催化的氧化反应转化为活性次氯酸（HClO）[11]、[12]。HClO和ONOO⁻作为最重要的ROS和RNS之一，在复杂的细胞和生物系统中共存，并在调节氧化还原平衡、信号转导和生物途径中发挥关键作用[13]、[14]。然而，HClO和ONOO⁻的过度生成会导致氧化应激，进而损伤脂质、蛋白质、DNA等生物分子，从而引发癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等多种疾病[15]、[16]、[17]。因此，开发能够同时监测活系统中HClO和ONOO⁻水平的有效工具至关重要。
荧光探针因其高空间和时间分辨率、灵敏度以及实时成像能力，已成为非侵入性监测活体生物物种的潜在工具[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。目前，已有大量荧光探针被用于检测生物系统中的HClO或ONOO⁻[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。然而，尽管HClO和ONOO⁻在生物系统中共存（见表S1和图S1）[35]、[36]、[37]、[38]，但只有少数探针能够同时区分并可视化这两种物质。虽然简单结合两种特异性探针似乎可以在单一系统中监测HClO和ONOO⁻，但这种方法存在光谱交叉干扰、细胞摄取、分布和代谢差异等问题。因此，迫切需要开发一种能够同时识别HClO和ONOO⁻并显示完全独立光谱信号的单一探针。
本文设计了一种新型“双锁定”探针RhB-ClO，通过两个独立的荧光通道依次可视化HClO和ONOO-。该探针通过将罗丹明和羟基苯丁二烯结合并使用二甲基硫代氨基甲酸酯（DMTC）掩盖其酚羟基来构建。当被HClO激活时，Cl+通过亲电加成作用于硫基团，导致DMTC基团断裂，释放出荧光团RhB-OH，从而恢复分子内的电荷转移（ICT）过程，产生红色荧光（发射波长700 nm）。随后，RhB-OH被ONOO⁻进一步激活，形成具有强绿色荧光信号（发射波长570 nm）的RhCO。由于两种荧光团的发射波长差异明显（130 nm），RhB-ClO能够在两个独立通道中同时检测HClO和ONOO⁻的变化，而不会产生光谱交叉干扰。该探针成功用于成像PC12细胞在氧化应激条件下的HClO和ONOO⁻变化。此外，RhB-ClO还能可视化铁死亡过程和APAP诱导的HepG2细胞损伤过程中HClO和ONOO⁻水平的升高。由于其低检测限，RhB-ClO还被用于筛选具有清除HClO和ONOO⁻能力的天然产物，以发现潜在的抗氧化治疗候选物。
