摘要背景
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症和癌症相关死亡的第二大原因，其死亡率主要归因于肝转移（CRLM），近50%的晚期CRC患者会发生肝转移。尽管系统治疗和手术干预有所改进，但CRLM患者的五年生存率仍然很低，迫切需要更好地理解驱动转移进展的分子机制并确定新的治疗靶点。越来越多的证据表明，转移前微环境（PMN）——在循环肿瘤细胞到达之前在远处器官建立的许可性微环境——在促进转移中起着关键作用。肝PMN由肿瘤源性可溶性因子协调，这些因子重塑细胞外基质（ECM）、改变血管通透性并招募免疫抑制细胞以创建有利的转移环境。在这些免疫成分中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），特别是那些具有M2样表型的巨噬细胞，已被确定为免疫逃避、血管生成和转移定植的关键介质。然而，CRC肝转移微环境内巨噬细胞极化的上游信号和调节分子仍未完全明确。
组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP1）经典地以其对基质金属蛋白酶（MMPs）的抑制作用而闻名，最近已成为一种与癌症进展相关的多功能蛋白。虽然最初因其抗蛋白水解活性而被认为是肿瘤抑制因子，但TIMP1现在被认为通过MMP非依赖性途径调节细胞增殖、凋亡抗性和转移来促进肿瘤发生。然而，TIMP1在塑造免疫微环境——特别是在CRLM期间调节巨噬细胞极化和PMN形成——中的确切作用仍知之甚少。
本研究探讨了CRC分泌的TIMP1是否通过CD63/β1-整合素–AKT/mTOR信号重编程肝巨噬细胞来驱动肝转移。通过结合患者数据集分析以及TIMP1表达增加或减少的细胞和小鼠模型，数据表明TIMP1是CRC肝转移的巨噬细胞依赖性驱动因子，促进M2极化、转移前微环境形成和转移定植。最后，检验了药理学阻断整合素信号是否能抑制TIMP1诱导的巨噬细胞重编程和肝转移。
TIMP1在CRC中过表达并与不良预后相关
为了鉴定与结直肠癌肝转移（CRLM）相关的关键基因，研究对四个独立的GEO数据集进行了整合转录组学分析。三个数据集比较了原发性CRC组织与匹配的正常粘膜，一个数据集比较了原发性CRC与相应的肝转移灶。对每个队列中在CRC或CRLM中显著上调的基因取交集，获得了共同的候选基因。共鉴定出四个重叠基因，其中TIMP1在TCGA队列中被进一步证实与不良总生存期相关。Kaplan-Meier生存分析显示，TIMP1高表达患者的总生存期显著差于低表达患者。使用TCGA和GTEx数据集比较肿瘤和正常组织中的TIMP1 mRNA水平，发现TIMP1在结肠腺癌（COAD）和直肠腺癌（READ）样本中均显著过表达。单细胞RNA测序数据显示TIMP1主要在上皮细胞中表达。CCLE数据库分析证实TIMP1在各种CRC细胞系中高表达。qPCR和ELISA检测证实CRC组织中TIMP1 mRNA表达显著升高，CRC患者血清中循环TIMP1水平也升高。Western blot分析验证了配对CRC组织中TIMP1蛋白的上调。免疫组织化学分析显示CRC组织中TIMP1表达显著增加，而正常组织显示弱或无染色。免疫组织化学评分进一步支持了110个CRC标本中TIMP1表达显著高于正常组织。按IHC分层的生存分析显示，TIMP1蛋白高表达患者的总生存期显著差于低表达患者。临床病理相关性分析显示，高TIMP1表达与淋巴结转移和远处转移显著相关，但与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤浸润深度或TNM分期无显著关联。单变量分析确定TIMP1表达、淋巴结转移和远处转移是影响五年总生存期的显著因素。多变量Cox回归证实高TIMP1表达是不良预后的独立预测因子。
CRC细胞可分泌TIMP1并促进CRLM
TIMP1是一种分泌到细胞外环境中的可溶性蛋白。为了验证其作为分泌蛋白在调节肿瘤微环境中的作用，研究在鼠源和人源CRC细胞系中建立了稳定的TIMP1敲低和过表达细胞系。qPCR分析证实shRNA介导的敲低或慢病毒过表达后，TIMP1 mRNA水平有效降低或升高。在蛋白质水平上，条件培养基的Western blot进一步证明，内源性TIMP1分泌在两个独立的shTIMP1构建体中显著降低，并在pLVX-TIMP1中增加。ELISA测量条件培养基显示，在MC38和CT26细胞中，过表达时TIMP1分泌增加，shRNA介导的敲低时分泌减少。
在C57BL/6小鼠的功能测定中，通过尾静脉输注蛋白质归一化、BCA匹配的条件培养基。每剂量每只小鼠含有100 μg总蛋白质在100 μL中，TIMP1-CM通过ELISA每剂量递送50 ± 8 ng TIMP1，内毒素低于0.1 EU/mL。蛋白质匹配的载体-CM和PBS作为对照。在第7天，通过脾内注射野生型MC38细胞。在第28天，生物发光成像量化肝定植，并收获肝脏进行H&E以验证和测量转移负荷。用TIMP1-CM预处理的小鼠显示出更高的肝生物发光、增加的肝重量和更大的转移受累百分比，表明CRC源性的TIMP1预处理肝脏以支持转移性生长。
接下来研究持续的肿瘤内在TIMP1生产是否从原位促进转移。使用盲肠植入模型，用载体或pLVX-TIMP1转导的MC38细胞，然后脾内注射MC38-WT细胞，强制TIMP1表达显著增加了肝生物发光、肝重量和转移受累百分比，并显著缩短了总生存期。相反，使用两个独立的shRNA构建体敲低TIMP1显著降低了肝转移负荷和肿瘤相关的肝脏增大。生存分析表明，与载体处理的对照组相比，TIMP1敲低显著延长了荷瘤小鼠的总生存期，表明TIMP1在促进CRLM中起关键作用并导致不良预后。
TIMP1以巨噬细胞依赖性方式促进CRLM
为了阐明TIMP1促转移功能背后的免疫细胞依赖性机制，研究结合了特定的免疫细胞耗竭策略使用了免疫缺陷小鼠模型。为了评估TIMP1驱动的肝转移是否依赖于T细胞，将稳定过表达TIMP1的CT26或MC38结直肠癌细胞植入缺乏功能性T细胞的BALB/c裸鼠中。与载体对照相比，TIMP1过表达在这些小鼠中显著增加了肝转移负荷，通过体内生物发光成像检测到。这些发现表明TIMP1的促转移效应独立于T细胞，从而表明其他免疫细胞群可能负责介导其促肿瘤活性。
为了探索巨噬细胞在介导TIMP1驱动转移中的作用，使用氯膦酸盐脂质体（CLD）耗竭巨噬细胞。值得注意的是，在CLD处理的小鼠中，TIMP1诱导的肝转移增强被完全消除。在CT26或MC38模型中，载体和pLVX-TIMP1组之间的肝荧光强度没有显著差异，证明巨噬细胞对于TIMP1介导的转移促进是不可或缺的。
为了进一步测试TIMP1条件化的巨噬细胞是否足以促进肝定植，进行了过继转移实验。与接受PBS处理巨噬细胞的小鼠相比，共同注射TIMP1处理巨噬细胞的小鼠显示肝重量增加和肝脏表面被转移灶占据的百分比更高。这些数据提供了额外的功能证据，表明TIMP1教育的巨噬细胞直接在体内促进结直肠癌肝定植。
为了确定其他先天免疫群体如中性粒细胞或自然杀伤（NK）细胞是否参与TIMP1驱动的转移，进行了抗体介导的耗竭实验。有趣的是，中性粒细胞或NK细胞耗竭对TIMP1诱导的肝转移没有任何明显影响。这些结果表明巨噬细胞是负责转导TIMP1在结直肠癌中促转移效应的关键免疫细胞类型。
TIMP1刺激重编程肝巨噬细胞基因表达
为了检查TIMP1的免疫调节作用，从BALB/c肝脏制备单细胞悬浮液，并通过FACS分离肝巨噬细胞。指示的部分被分选，用或不用重组TIMP1培养48小时，并进行RNA测序。差异基因表达分析鉴定了rTIMP1处理组中308个上调和230个下调的基因。值得注意的是，M2相关基因如CSF1、IRF4和CD36被上调，而几个促炎基因包括Tlr3、Nfkbid和Tlr13被下调。通过qPCR在RAW264.7和THP-1衍生的巨噬细胞中验证关键靶标，证实rTIMP1处理显著增加了CSF1、IRF4、CD36和Plat的mRNA表达，同时降低了Tlr3、Tlr13和Nfkbid的水平，支持向抗炎巨噬细胞表型的转变。
RNA-seq数据的无监督层次聚类进一步证明了rTIMP1处理和载体组之间不同的转录谱，差异表达基因清晰分离。基因本体（GO）分析显示，rTIMP1调节的基因在与免疫调节、膜成分和细胞因子活性相关的术语中富集。同时，KEGG通路分析确定了PI3K–Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和JAK–STAT信号的显著富集，表明TIMP1影响多个免疫相关信号通路。
TIMP1驱动巨噬细胞M2极化和转移前微环境形成
为了检查TIMP1是否影响巨噬细胞极化，分析了鼠源RAW264.7巨噬细胞和人源THP-1衍生巨噬细胞中M2相关标志物的表达。免疫荧光染色显示，用IL4/IL13或重组TIMP1（rTIMP1）处理增加了CD163和CD206的表达，与M2样极化表型一致。一致地，Western blot分析证实rTIMP1促进M2相关标志物（CD204、CD206和CD163）的上调，与IL4/IL13刺激相当。
接下来，流式细胞术分析证明rTIMP1处理显著降低了iNOS阳性巨噬细胞（代表性M1标志物）的比例，同时增加了CD206阳性巨噬细胞的频率，进一步支持其在驱动M2极化中的作用。
鉴于肝免疫微环境在肿瘤细胞到达之前经历重编程以建立转移前微环境，研究进一步调查了TIMP1在此过程中的作用。将过表达TIMP1的CT26细胞原位注射到裸鼠盲肠中，七天后收集肝脏进行多重免疫组织化学（mIHC）。结果显示，与对照组相比，TIMP1过表达组中F4/80和CD206双阳性M2样巨噬细胞的比例显著更高，表明CRC源性的TIMP1促进M2样巨噬细胞在肝免疫微环境中的积累以建立转移前微环境。总之，CRC源性的TIMP1可以诱导巨噬细胞M2极化，促进免疫逃避并重塑肝脏微环境以建立转移前微环境，从而增强结直肠癌细胞在肝脏中的生存和定植能力。
TIMP1与CD63和β1-整合素相互作用以激活AKT/mTOR信号并促进M2巨噬细胞极化
为了研究TIMP1调节巨噬细胞极化的分子机制，首先检查了TIMP1是否与巨噬细胞中已知的表面受体物理相互作用。使用RAW264.7和THP-1衍生巨噬细胞的共免疫沉淀（Co-IP）测定显示，TIMP1与CD63和β1-整合素形成复合物。内源性TIMP1的免疫沉淀导致在两种细胞类型中β1-整合素的共沉淀，而在IgG对照样品中未观察到相应信号，支持这种相互作用的特异性。此外，CD63的敲低减少了TIMP1和β1-整合素之间的关联，表明CD63有助于这种复合物的形成。
接下来评估了CD63和β1-整合素在TIMP1诱导的巨噬细胞极化中的功能相关性。流式细胞术分析显示，用重组TIMP1处理增加了CD163+M2样巨噬细胞的比例相对于PBS处理的对照。相反，使用特异性siRNAs沉默CD63或β1-整合素减弱了rTIMP1诱导的CD163+细胞的增加，表明两种分子对于有效诱导M2表型是必需的。
鉴于AKT/mTOR通路在巨噬细胞极化和免疫代谢调节中的既定作用，进一步检查了该通路是否参与TIMP1介导的信号传导。Western blot分析证明rTIMP1处理增加了RAW264.7和THP-1衍生巨噬细胞中AKT、PRAS40和mTOR的磷酸化。这种效应在存在IL4和IL13（经典的M2极化细胞因子）的情况下进一步增强，表明TIMP1和Th2型细胞因子之间存在潜在的协同机制。重要的是，沉默CD63或β1-整合素消除了TIMP1诱导的AKT、PRAS40和mTOR的磷酸化，进一步支持TIMP1通过CD63/β1-整合素介导的AKT/mTOR轴激活发挥其免疫调节功能。
Cilengitide阻断TIMP1诱导的M2极化并减少体内肝转移
为了确定靶向整合素信号轴是否可以中和TIMP1的促肿瘤效应，用Cilengitide处理巨噬细胞，Cilengitide是一种选择性阻断αvβ3和αvβ5整合素并部分干扰β1-整合素相关信号的环状RGD肽抑制剂。流式细胞术分析显示，用Cilengitide处理显著降低了rTIMP1处理巨噬细胞中CD163+和CD206+细胞的百分比，表明M2标志物表达受到抑制，并表明TIMP1诱导的极化程序被破坏。与遗传数据提示的β1-整合素依赖性一致，β1-整合素阻断抗体（AIIB2）类似地减弱了rTIMP1诱导的CD163+和CD206+巨噬细胞极化。
与此一致，Cilengitide有效废除了rTIMP1诱导的AKT/mTOR信号通路的激活，如AKT、PRAS40和mTOR磷酸化的减少所示。此外，使用AKT抑制剂MK2206或mTOR抑制剂雷帕霉素在整合素下游直接药理学抑制减少了响应rTIMP1的CD163+和CD206+细胞的比例，提供了额外的机制支持，表明AKT/mTOR信号是TIMP1驱动M2极化所必需的。
接下来使用结直肠癌肝转移模型评估了TIMP1过表达和Cilengitide处理的体内后果。在接种过表达TIMP1的CT26细胞（pLVX-TIMP1）的BALB/c裸鼠中，生物发光成像显示与载体对照相比肝转移负荷显著增加。然而，用Cilengitide治疗显著降低了肝肿瘤信号强度。肝组织的大体形态学检查和H&E染色证实了Cilengitide治疗组转移结节和肝重量的显著减少。此外，pLVX-TIMP1组的小鼠表现出显著缩短的生存期，而Cilengitide治疗延长了总生存期，使其恢复到接近对照水平。与β1-整合素信号在此过程中的作用一致，在CT26-pLVX-TIMP1模型中的AIIB2处理部分逆转了TIMP1过
