魏文|李一志|黄欣欣|夏海阳|陈春华|丁珊|卢璐|李丽华|刘明贤|周长仁|罗炳宏
济南大学化学与材料学院材料科学与工程系生物材料研究实验室，广州，510632，中国
摘要
骨样组织的液晶（LC）状态和快速应力松弛的粘弹性对细胞行为调节至关重要，但通过简单的方法在骨修复材料中模拟这些特性具有挑战性。在这里，我们利用几丁质 whisker（CHWs）的天然液晶特性和纳米级刚性，通过一种简单的双重物理交联策略开发出具有多种骨样组织特性的新型 CHWs/聚乙烯醇（CHWs/PVA）液晶水凝胶。CHWs 的自组装与 PVA 链相结合，使水凝胶具有骨样组织的液晶状态和粘弹性。冻融诱导的微晶结构（牺牲键）和 Hofmeister 增强的氢键可以作为多尺度层次能量耗散机制，赋予水凝胶快速应力松弛速率以及高且可调的模量。我们发现，YAP 依赖的机械转导和液晶状态介导的蛋白质聚集可以协同促进骨间充质干细胞的成骨分化，此外，这种积极效应可以通过调节水凝胶的模量、应力松弛和液晶特性来灵活调控。这项研究为设计类骨样仿生材料提供了新的见解，并进一步阐明了增强、增韧以及成骨分化的机制。
引言
骨样组织通过其独特的胆甾液晶（LC）状态（Giraud Guille 等，2005；Won 等，2015）、粘弹性和快速应力松弛特性来调节细胞行为。当细胞接触到骨样组织时，它们通过肌动蛋白感知这些拓扑和机械信号，随后激活 YAP 和其他机械敏感通路来指导粘附、增殖和分化（Dupont 等，2011；Huebsch 等，2010）。手性液晶的拓扑结构可以促进与粘附相关的蛋白质的吸附，并直接指导骨间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化和生物矿化（Li, Liu 等，2023）。此外，BMSCs 在硬质基底上倾向于成骨分化，而在软基质上则倾向于成脂分化（Hsieh 等，2016）。另外，细胞在应力松弛时间较短的基质上粘附得更好（Chaudhuri 等，2016；Chaudhuri, Cooper, Janmey, Mooney 和 Shenoy，2020）。
在合成材料中再现骨样组织的复杂微环境仍然是骨组织工程中的一个重要挑战。几丁质 whisker（CHWs）是一种天然的碳水化合物聚合物，能够形成与骨样组织结构类似的胆甾向列液晶相（Liu, Li 等，2022；Liu, Tang 等，2022；Tang 等，2022），为构建类骨样材料提供了理想的基础平台。这种液晶拓扑结构可以发挥双重作用：通过独特的能量耗散机制增强机械强度，并提供必要的拓扑线索来指导细胞反应。然而，基于 CHWs 的液晶组装在骨修复中的实际应用受到其固有缺点的限制，包括尺寸稳定性和机械强度不足。将聚合物网络引入 CHWs 液晶中以构建类骨样复合液晶水凝胶可能是一种有效的方法。水凝胶被广泛用作基质材料，因为它们可以模拟骨样组织的结构和性质，如高水分含量、多孔网络结构和粘弹性（Xiao 等，2023）。然而，传统的水凝胶通常缺乏足够的强度来满足骨修复的需求。已经提出了许多策略来改善水凝胶的机械性能，包括引入增强剂以及设计拓扑结构和双重交联（Haraguchi & Takehisa，2002；Okumura & Ito，2001；Zhang 等，2017）。其中，双重交联水凝胶因其优异的机械性能而受到广泛关注。对于骨修复，化学交联的水凝胶具有高刚性，但应力松弛缓慢且可能存在细胞毒性，而物理交联的水凝胶表现出快速的应力松弛行为和可调节的模量，但缺乏强度。我们之前的 CHW/壳聚糖（CS）水凝胶结合了化学和物理双重交联，获得了良好的机械强度和相对快速的应力松弛行为（Liu, Li 等，2022）。然而，应力松弛行为仍有改进的空间，此外，用于化学交联的genipin具有细胞毒性且交联时间过长。为了设计类骨样材料，同时实现高模量和快速应力松弛仍然是一个挑战，以 CHWs 为中心的双重物理交联策略可能提供一个更简单和有效的解决方案。聚乙烯醇（PVA）因其生物相容性和通过冻融循环形成物理水凝胶的能力而在生物医学领域得到广泛应用（Kumar & Han，2017；Li, Wu 等，2023；Ricciardi 等，2004）。然而，单网络 PVA 水凝胶需要进一步增强以改善机械强度，同时保持类骨样的应力松弛以促进成骨。Hofmeister 效应提供了一种高效的方法，可以实现可逆的离子介导交联，进一步增强 PVA 水凝胶，并允许调节模量和快速应力松弛（Jaspers 等，2015；Wu 等，2021）。
在这里，我们提出了一种双重物理交联策略来构建具有多种骨样组织特性的 CHW/PVA 液晶水凝胶。这种方法利用基于碳水化合物的 CHWs 的内在液晶形成能力作为结构基础。首先通过将 PVA 引入 CHWs 液晶相中建立初级物理交联网络，利用氢键和通过反复冻融形成的微晶结构。然后通过盐诱导的 Hofmeister 效应引入次级物理交联，这增强了氢键并促进了微晶结构的形成，从而形成更密集的网络。我们假设这种以 CHWs 为中心的设计不仅赋予液晶水凝胶高模量，还具有快速应力松弛，更重要的是，由于 Hofmeister 效应的可逆性，液晶水凝胶的模量可以灵活调节（图 1a）。此外，水凝胶可以通过涉及 CHW 拉出、液晶重组和可逆 H-键断裂/重组的层次机制来耗散能量，其中微晶结构可以作为牺牲键（图 1b）。我们还假设，由于水凝胶的独特液晶状态和类骨样的机械特性，它们可以促进蛋白质吸附和 YAP 介导的机械转导，从而协同增强 BMSCs 的成骨分化（图 1c）。这种新型液晶水凝胶集成了类骨样液晶拓扑结构、高模量和快速应力松弛，与一些仅模仿骨样组织单一方面的报告中的骨修复水凝胶相比，在结构和性能上具有一定的优势（表 S1）。我们的工作强调了利用天然碳水化合物聚合物（如几丁质）设计先进仿生材料的潜力，为创建具有平衡机械性能和生物活性的类骨样平台提供了一条简单的方法。
原始α-几丁质、聚乙烯醇（PVA，类型 1799，分子量约为 7.11×10^4–7.99×10^4 g/mol，纯度为 98%–99%）和硫酸钠（AR）来自上海 Macklin 生化有限公司。盐酸（AR）购自广州化学试剂厂。磷酸盐缓冲液（PBS）由 Thermo Fisher Scientific 公司提供。
CHW/PVA 水凝胶的制备步骤如下：首先，将 0.75 g 的 CHW 分散在去离子水中，并进行超声处理
制备好的 CHWs 呈现出针状形态，具有高长宽比（图 2a 和 S1）。在 CHWs 的 XRD 光谱中可以观察到对应于 (020)、(021)、(110)、(120)、(130) 和 (013) 晶面的衍射峰（图 S2），这与之前关于 α-几丁质的报告一致。此外，CHWs 的结晶度约为 90.95%。进一步地，通过超声处理制备的 CHWs 悬浮液表现出双折射和明显的指纹效应
总之，我们提出了一种简单的双重物理交联策略，成功利用了 CHWs（一种基本的碳水化合物聚合物）的天然液晶特性，制备出了新型类骨样液晶水凝胶。这些水凝胶含有冻融诱导的微晶结构（牺牲键）和 Hofmeister 增强的氢键。层次化的能量耗散级联机制使得同时实现类骨样液晶状态、可调模量和快速应力松弛成为可能
魏文：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，软件，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。
李一志：方法学，研究。
黄欣欣：正式分析，数据管理。
夏海阳：软件，方法学。
陈春华：软件，方法学。
丁珊：数据管理，概念化。
卢璐：方法学，概念化。
李丽华：软件，方法学，概念化。
刘明贤：数据管理。
没有需要声明的利益冲突。
本工作得到了 国家自然科学基金（32471409）和 广东省基础与应用基础研究基金（2025A1515011417、2023A1515010107 和 2022A1515010592）以及 广东省脊柱和脊髓重建重点实验室开放基金（2023B121203001）的支持。
