小细胞肺癌（SCLC）是一种高级神经内分泌癌，约占所有肺癌（LC）诊断的15%（Keogh等人，2022年）。其特征是细胞快速增殖、早期转移和显著的肿瘤内异质性，这些因素共同导致了较差的预后和侵袭性的临床进程。大约80-85%的SCLC患者在诊断时已处于晚期（ES-SCLC），此时转移已经发生。因此，5年生存率非常低，约为5%（Van Meerbeeck等人，2011年；Knight等人，2017年）。
尽管最近的治疗进展（包括免疫检查点抑制剂）在一定程度上改善了部分患者的生存情况，但大多数SCLC患者仍会迅速复发并对标准治疗产生耐药性（Herzog等人，2021年；Rudin等人，2021年）。从遗传学角度来看，SCLC的特点是肿瘤抑制基因TP53和RB1几乎普遍失活（Fűr等人，2024年；Jiao等人，2022年）。然而，由于这些突变破坏的是调控通路而非激活致癌通路，因此它们作为治疗靶点的效用有限。与其他LC亚型不同，SCLC缺乏可用于精准治疗的明确、疾病特异性的突变。这一挑战因高质量肿瘤样本的缺乏（尤其是可切除病例）以及综合基因组数据集的有限可用性而加剧。
尽管存在这些障碍，但已知SCLC具有较高的突变负担（Boumber，2018年）和显著的转录可塑性（Jin等人，2023年），这些特征表明可能存在尚未发现的体细胞突变（SMs），这些突变可能在疾病进展中起功能性作用。体细胞突变源于非生殖细胞的DNA改变，当它们发生在提供选择性生长优势的驱动基因中时，可能会破坏基因功能或调控。在肿瘤中检测到这些突变具有重要的临床价值，尤其是当突变发生在触发致癌作用并支持肿瘤进展的驱动基因中时。识别这些驱动突变不仅对于将SCLC患者与现有靶向疗法匹配至关重要，而且对于指导新疗法的开发也具有重要意义（George等人，2024年；Katzir等人，2022年；Das和Samaddar，2025年）。此外，体细胞突变可以揭示环境暴露或治疗耐药的突变特征，并可能作为患者分层的生物标志物（Li等人，2024年）。
历史上，体细胞突变的检测依赖于低通量方法，如Sanger测序和RT-PCR。这些技术仅限于预定义的基因组区域，因此无法实现全基因组的发现（Katzir等人，2022年；Tang等人，2024年）。下一代测序（NGS）技术的出现，包括全外显子测序（WES）和全基因组测序（WGS），使得能够在广泛的基因组区域内高效且经济地识别体细胞突变（Kim等人，2024年；Liu等人，2021年）。在SCLC中，这些技术为肿瘤演化和耐药性提供了见解。例如，使用WES和WGS的研究表明，TP53和RB1突变通常是肿瘤发生的早期事件，并将某些突变特征与化疗耐药性和免疫反应联系起来（George等人，2024年；Wang等人，2021年；Wang等人，2022年）。虽然WGS提供了全面的全基因组视图，但其高昂的成本和计算需求限制了其常规使用，因此在研究和临床应用中WES更为实用。然而，由于WES仅限于蛋白质编码区域，它无法捕获调控改变或表达水平的变化，因此需要转录组学方法，如RNA测序（RNA-seq）（Goodwin等人，2016年；Belkadi等人，2015年）。
同时，人类基因组组装技术的进步显著提高了基于DNA和RNA的测序分析的准确性。端粒到端粒CHM13（T2T-CHM13）组装作为第一个真正完整的人类参考基因组，通过解析着丝粒、片段重复和其他重复元素，优于GRCh38（Nurk等人，2022年）。这一改进的参考基因组增强了读段比对、突变调用和结构变异检测，特别是在癌症中频繁改变的复杂基因组区域（Paulin等人，2025年）。在SCLC中，使用T2T-CHM13可能揭示GRCh38忽略的新突变特征和调控扰动。此外，RNA-seq已成为检测表达外显子中低频体细胞突变的宝贵工具，由于肿瘤内异质性，基于DNA的方法可能会遗漏这些突变（Coudray等人，2018年）。尽管基于RNA-seq的突变调用算法（如RNA-MuTect）已在多种癌症类型中得到验证（Tang等人，2024年），但其在SCLC中的系统应用仍然有限，代表了新的基因组发现的前沿。
在这项研究中，我们使用了SCLC肿瘤和正常样本的RNA-seq数据集来识别体细胞突变。我们还比较了GRCh38和T2T-CHM13参考基因组在SCLC背景下的突变检测能力。通过利用精心策划的基因组数据库对识别出的突变进行功能注释，以评估它们的潜在生物学意义。此外，还进行了功能富集分析，进一步研究这些突变对癌症相关通路的影响，重点关注罕见、非同义和剪接位点突变，这些突变更有可能影响蛋白质功能并促进疾病进展。通过结合参考引导的注释和新的体细胞突变发现方法，本研究旨在揭示具有临床相关性的突变，并为未来的精准肿瘤学策略确定潜在的治疗靶点。
