利用 CRISPR-Cas13 系统治疗遗传性视网膜疾病的研究进展

英国牛津大学纳菲尔德临床神经科学系和 NIHR 牛津生物医学研究中心的 Lewis E. Fry 等人在Communications Biology期刊上发表了题为 “Comparison of CRISPR-Cas13b RNA base editing approaches for USH2A-associated inherited retinal degeneration” 的论文。该研究聚焦于遗传性视网膜疾病的治疗，对 CRISPR-Cas13 系统在修复 USH2A 基因突变方面的应用进行了深入探究，为开发针对视网膜疾病的转录组靶向基因编辑疗法提供了重要依据，有望为众多遗传性视网膜疾病患者带来新的治疗希望。

一、研究背景

遗传性视网膜疾病（IRDs）是导致工作年龄人群不可逆视力丧失的常见原因，大约每 2000 人中就有 1 人患病。USH2A 基因的致病性变异是 IRDs 的主要病因之一，它与常染色体隐性非综合征性视网膜色素变性以及 Usher 综合征 II 型相关，后者的特征为先天性感音神经性听力损失和视网膜色素变性。

USH2A 基因编码 usherin 蛋白，其编码序列长达 15.6kb，远超腺相关病毒（AAV）载体约 4.7kb 的包装容量，这使得传统的 AAV 基因替代治疗策略难以实施。因此，寻找替代的治疗方法迫在眉睫。RNA 碱基编辑技术为校正 USH2A 基因中的常见 G>A 突变提供了一种可行途径，成为研究的热点方向。

CRISPR-Cas13 系统是一种 RNA 引导和 RNA 靶向的 VI 型 CRISPR 系统，在 RNA 编辑领域展现出巨大的治疗潜力。通过与作用于 RNA 的腺苷脱氨酶（ADAR）效应器结合，可实现靶向的 A-I 碱基转换，为精确校正 RNA 中的点突变提供了可能。在该研究中，科研人员旨在比较 Cas13 效应器 PspCas13b 和 Cas13bt3 在修复 USH2A 基因方面的效果，探索其在治疗遗传性视网膜疾病中的可行性。

二、研究材料与方法

（一）材料

实验所用的质粒部分来自 Feng Zhang 等人的馈赠，部分通过合成和克隆获得。实验细胞为 HEK293T 细胞，实验动物为小鼠，在实验过程中严格遵循相关动物实验伦理规范。

（二）方法

质粒构建：利用限制酶克隆或多片段组装技术构建各种质粒，包括用于 RNA 编辑报告的双荧光素酶质粒、用于 AAV 生产的质粒以及测试短启动子序列的质粒等。
双荧光素酶测定：在 HEK293T 细胞中进行双荧光素酶测定，通过检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，评估 RNA 编辑效率。
AAV 生产：采用三转染法生产具有 AAV8-Y733F 衣壳的载体，通过超速离心和过滤等步骤进行纯化，并对其纯度、内毒素水平和病毒基因组浓度进行检测。
动物实验：使用修复了 Cdh23 等位基因的 C57BL/6 J 背景小鼠，通过 CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复技术构建 Ush2aW3947X/W3947X 小鼠模型。对小鼠进行基因分型、拷贝数计数测定、听觉脑干反应测试、视网膜成像、视网膜电图检测、视网膜下注射等实验操作。
分子生物学检测：进行 RNA 提取、逆转录、RNA 测序、RT-PCR、蛋白质提取、western blot、视网膜免疫组织化学和耳蜗免疫组织化学等实验，以检测基因编辑效果、蛋白表达和定位等情况。

（三）关键技术路线

首先构建包含不同 Cas13 效应器和 gRNA 的质粒，在细胞水平利用双荧光素酶测定筛选出高效的编辑组合。接着构建 Ush2aW3947X/W3947X 小鼠模型，用于体内实验。将构建好的 AAV 载体通过视网膜下注射导入小鼠体内，利用多种检测技术评估基因编辑效率、蛋白表达恢复情况以及对视网膜结构和功能的影响。

三、研究结果

（一）体外比较 Cas13 - ADAR 同源物对 USH2A 和 Ush2a 的编辑效率

筛选 gRNAs：科研人员开发了一种双荧光素酶测定法，在 HEK293T 细胞中比较 Cas13 - ADAR 同源物对人 USH2A c.11864 G>A 和小鼠 Ush2a c.11840 G>A 提前终止密码子的校正效率。针对 USH2A 靶点，具有 36nt 错配距离的 gRNA（50 nt - 36）编辑率最高，达到 38%；对于 Ush2a 靶点，除了具有 24nt 错配距离的 gRNA（mUsh2a - 24 - G10）编辑率为 50% 外，其他 gRNA 编辑率普遍较低（<20%）。
评估 Cas13bt 同源物：测试了三种 Cas13bt 同源物（Cas13bt1、Cas13bt3 和 Cas13bt5）与 ADARDD（E488Q）结构域连接的编辑活性。结果显示，30nt 的 gRNA 编辑率均低于 10%，而 50nt 的 gRNA 编辑率最高可达 21%，其中 Cas13bt3 与 50 nt - 28 的 gRNA 组合编辑率达到 17%。
确认编辑机制：去除 gRNA 的直接重复序列后，萤火虫荧光素酶的恢复被消除，证实了靶向编辑是由 gRNA - Cas13 相互作用招募 ADAR 引起的，而非过表达或内源性 ADAR 直接与双链 RNA 相互作用。

（二）比较 ADARDD 变体和 Cas13 截短体

ADAR 变体比较：比较了 ADARDD（E488Q）和 ADARDD（E488Q/T375G）两种变体，发现 ADARDD（E488Q/T375G）虽然可降低脱靶编辑的可能性，但与 ADARDD（E488Q）相比，其靶向编辑效率显著降低。
Cas13 截短体评估：评估了 C 末端截短的 dPspCas13b（del）构建体与全长 dPspCas13b 的编辑效率，结果表明 C 末端截短的 Cas13b 构建体在编辑效率上并未降低，甚至在与 E488Q 变体结合时，平均绝对编辑率比全长构建体高 8.3%±2.3。

（三）通过 Sanger 测序确定的靶向和脱靶编辑率

靶向编辑确认：对样本的 PCR 扩增子进行 Sanger 测序，结果显示使用 dPspCas13b（del） - E488Q 构建体时，USH2A 和 Ush2a 靶点的靶向编辑率分别为 77% 和 86%，高于荧光素酶测定的结果，但两者具有相关性。
脱靶编辑分析：E488Q 构建体在 hUSH2A（2 个位点）和 mUsh2a（8 个位点）靶点均出现脱靶编辑，而 E488Q/T375G 脱氨酶突变体更具特异性，仅在靶腺苷处编辑，无脱靶编辑现象。在 mUsh2a 转录本中，即使在没有双链 gRNA - 靶复合物的情况下，也可能由于序列或结构特征增加脱靶脱氨的可能性。

（四）生成用于 RNA 编辑的 Ush2aW3947X/W3947X 小鼠

小鼠模型构建：通过 CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复技术，将 Ush2a c.11840 G>A（p.W3947X）突变引入小鼠基因组，成功构建了 Ush2aW3947X/W3947X 小鼠模型。
表型分析：Western blot 和免疫荧光结果显示，Ush2aW3947X/W3947X 小鼠视网膜中无 usherin 蛋白表达，在连接纤毛处也未检测到 usherin 免疫反应性。听觉脑干反应测试表明，该小鼠存在听力障碍，ABR 阈值显著升高。然而，在 24 个月的观察期内，该小鼠视网膜在功能和结构上未出现明显的退行性变化。

（五）生成用于 AAV 递送 dPspCas13b 的 RNA 编辑转基因

载体构建：为了将 dPspCas13 - E488Q（4.15kb）包装到 AAV 载体中，测试了不同的启动子和 polyA 元件。最终设计了双载体和单载体两种 AAV 递送系统，双载体系统分别使用 EFS 或 RK 启动子驱动 dPspCas13b 表达，单载体系统则使用最小的 dCas13bt3 同源物。
编辑效率评估：在 Ush2aW3947X/W3947X 小鼠体内进行实验，结果显示使用 RK 启动子的双载体 dPspCas13b 系统编辑效率最高，可达 2.04%±0.16；EFS - dPspCas13b 系统编辑效率为 0.93%±0.57；单载体 RKdCas13bt3 系统编辑效率为 0.32%±0.06。免疫荧光分析表明，使用双载体 RK - dPspCas13 - E488Q 系统的小鼠视网膜中，usherin 蛋白得到了一定程度的恢复。

（六）AAV 递送 Cas13 - ADAR 对 Ush2a 的脱靶编辑

脱靶编辑分析：通过深度测序分析 Ush2a 转录本中旁侧腺苷的脱靶转换情况，发现 dPspCas13b 的脱靶编辑主要集中在 gRNA 结合形成的 dsRNA 区域，但也会在转录本其他位置零星出现。RK 驱动的载体比 EFS 驱动的载体具有更高的编辑率和更多的编辑位点。
编辑精度评估：分析表明，每种载体校正为野生型序列的转录本中，70 - 85% 在分析区域内没有额外的脱靶 A>G 编辑。

（七）AAV 递送 Cas13 - ADAR 对视网膜结构的影响

视网膜厚度测量：通过体内光学相干断层扫描（OCT）测量视网膜厚度，发现所有注射组在注射后均出现视网膜变薄的情况，且 AAV 注射组比 PBS 注射组更为明显。高剂量的 gRNA - GFP 载体可能是导致视网膜变薄的主要原因。
结构变化观察：在视网膜变薄的眼睛中，主要观察到外视网膜的变化，包括高反射椭圆体区和外部限制膜带的丢失。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

该研究成功利用基于 Cas13 的 RNA 编辑器，有效校正了 USH2A 基因中导致致病性提前终止密码子的常见突变（c.11864 G>A，p.W3955X）。同时，通过 AAV 介导的体内递送 dPspCas13b - ADAR2dd，首次在小鼠视网膜中实现了对 Ush2a 基因同源突变（c.11847 G>A；p.W3947X）的体内 RNA 编辑，并恢复了 usherin 蛋白的表达。

（二）讨论

编辑系统的优势与不足：RNA 编辑为校正可编辑的致病性转换变异提供了潜在的治疗策略，在遗传性视网膜疾病中具有重要应用前景。研究中使用的 dPspCas13b - ADAR 系统在体外和体内均展现出一定的编辑活性，但也存在脱靶编辑和编辑效率有待提高的问题。Cas13bt 构建体虽因尺寸小具有潜在优势，但活性明显低于 PspCas13。
体内编辑效率的影响因素：体内不同启动子和 Cas13 效应器的比较为治疗方法的开发提供了重要见解。使用双载体 dPspCas13b - ADAR2DD 系统，通过光感受器特异性 RK 启动子驱动表达，在 Ush2a 基因中实现了 2% 的突变校正，但这一效率可能因转导细胞比例等因素而被低估。EFS 启动子在体外效率良好，但在体内光感受器中的活性较差。
脱靶效应与视网膜毒性：脱靶脱氨事件在靶转录本的局部腺苷处发生，dPspCas13b 的脱靶编辑集中在 dsRNA 区域，dCas13bt3 则在转录本中产生更广泛的零星脱靶。未来需要进行转录组范围的脱靶分析，并优化效应器以减少脱靶编辑。此外，AAV - Cas13 构建体注射后导致的视网膜变薄问题需要进一步研究，明确其原因是 gRNA - GFP 载体、dCas13b 和 / 或 ADAR2DD（E488Q），还是其他因素。
动物模型的特点与应用：Ush2aW3947X/W3947X 小鼠模型虽未观察到明显的视网膜变性表型，但其在测试基因编辑治疗的体内效率和评估蛋白表达恢复方面具有重要价值。该模型与其他 Ush2a 小鼠模型的差异，可能与突变位点在转录本中的位置不同有关，需要进一步深入研究。
未来研究方向：未来研究应致力于提高 Cas13 - RNA 编辑工具的效率和特异性，例如通过开发更高效的短 Cas13 效应器、优化 gRNA 设计等方法。同时，需要进一步研究 RNA 编辑在体内的长期效果和安全性，为将 RNA 编辑技术转化为临床治疗遗传性视网膜疾病的有效手段奠定基础。

综上所述，该研究为遗传性视网膜疾病的治疗提供了新的思路和方法，尽管目前仍面临诸多挑战，但 RNA 编辑技术在该领域展现出的潜力值得进一步深入探索和研究。