基因组分析揭示脊髓性肌萎缩症（SMA）患者 SMN1基因区域奥秘：为精准诊断 “添砖加瓦”

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种常染色体隐性神经肌肉疾病，现有基因检测方法存在局限。东京女子医科大学研究人员开展对临床诊断为 SMA 患者的 SMN1基因区域基因组分析，发现新突变和杂交基因，强调全长测序对 SMA 诊断的重要性。

脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种令人揪心的常染色体隐性神经肌肉疾病，就像隐藏在身体里的 “恶魔”，悄无声息地破坏着患者的健康。它主要表现为肌肉无力和萎缩，是导致婴儿死亡的重要遗传病因之一。在全球，大约每 10000 个活产婴儿中就有 1 例发病，在日本，这一比例约为 1/20000。

SMA 根据发病年龄和疾病严重程度可分为不同亚型。1 型最为严重，患者在 6 个月前就会出现临床症状，甚至需要借助呼吸机维持生命；2 型患者在 18 个月前发病，虽然能独坐，但无法独立站立或行走；3 型患者发病于 18 个月之后，疾病进展会让他们逐渐失去行走能力；4 型则是成年发病，通常在 30 岁之后。

从基因角度来看，大多数 SMA 患者的 5 号染色体 q13 区域的生存运动神经元 1（Survival Motor Neuron 1，SMN₁）基因存在纯合子基因缺失或功能丧失突变。而与之高度同源的 SMN₂基因，虽然也能编码 SMN 蛋白，但由于外显子 7 的 840C>T 核苷酸差异，影响了剪接模式，产生的转录本缺少外显子 7，编码的是无功能的 SMN 蛋白。SMN₂基因拷贝数与疾病严重程度相关，拷贝数越多，病情相对越轻。

近年来，随着 SMA 疾病修饰疗法的出现，基因检测变得愈发重要。然而，目前临床常用的多重连接依赖探针扩增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）方法只能检测 SMN₁基因的拷贝数变异，无法捕获外显子和内含子内的基因变异，导致部分临床诊断为 SMA 的患者无法通过该方法进行基因确诊。为了突破这一困境，东京女子医科大学的研究人员开展了一项重要研究。

研究人员进行了一项回顾性观察研究，使用预先收集的临床确诊 SMA 患者的 DNA 样本。他们修改了长程聚合酶链反应（Long-range Polymerase Chain Reaction，LR-PCR）方法的引物，使其能够进行下一代测序（Next-generation Sequencing，NGS），从而对 SMN₁基因的所有外显子和内含子进行分析，旨在明确 SMA 的基因诊断，并识别可能具有临床影响的单核苷酸变异（Single Nucleotide Variant，SNV）。

在研究过程中，研究人员从最初的 336 份 DNA 样本中，排除了 158 份 SMN₁外显子 8 拷贝数为 0 的样本，因为这些样本不适合使用 LR-PCR 方法。最终，62 份样本被纳入研究。

患者特征：研究队列包括成人和儿童患者，涵盖 SMA 的 1 - 4 型。半数患者的最大运动功能是爬楼梯，部分患者还进行了气管切开术。在 SMN₁外显子 7 拷贝数方面，7 名患者为 0 拷贝，7 名患者为 1 拷贝。

SMA 的基因诊断：通过 MLPA 分析 SMN 基因拷贝数后，对 62 份样本进行测序分析。两名女性患者被确定存在致病突变，从而得到基因诊断。一名 9 岁患者，1 岁时进行了气管切开术，3 岁时进行了胃造瘘和胃底折叠术，其 SMN₁外显子 7 和 8 各有 1 拷贝，SMN₂外显子 7 和 8 各有 2 拷贝，测序发现 SMN₁内含子 6 存在杂合突变（c.835 - 3C>A）。另一名 56 岁患者，12 岁出现左脚肌肉无力，30 岁需要拐杖辅助行走，45 岁依赖轮椅，家族中有近亲结婚史，其 SMN₁和 SMN₂外显子 7 和 8 均为 2 拷贝，测序发现外显子 3 存在新的纯合错义突变（c.284G>A；p.G95E）。

改良 LR-PCR 扩增方法：对 13 份 DNA 样本进行改良 LR-PCR，成功扩增出包含 SMN₁外显子 1 - 8 的 28.2kb 区域。NGS 分析显示，从外显子 1 到内含子 1 有良好的覆盖度，并检测到内含子 1 中以前未知的 SNV。

SMN₁ SNV 分析：在 62 份样本中，在 SMN₁内含子 6 中鉴定出 3 个感兴趣的 SNV，分别为 c.835 - 367C>A（n = 5）、c.834 + 1751G>A（n = 2）、c.834 + 1506A>G（n = 9）。其中，c.835 - 367C>A 和 c.834 + 1506A>G 在 SMN₁外显子 7 拷贝数为 0 的患者中出现频率显著更高。

杂交 SMN 分析：对 5 名 SMN₁外显子 7 纯合缺失但外显子 8 未缺失的患者进行杂交 SMN 基因检测，确认了一种新的杂交 SMN 基因类型，其序列为 taaTggG，由 SMN₁的上游 “t” 和下游 “G” 序列以及 SMN₂的 “aaTgg” 序列组成。

研究结果表明，目前用于 SMA 基因诊断的 MLPA 方法无法检测所有 SMN 基因变异，需要额外的方法来实现准确的基因诊断。研究中发现的新突变和杂交基因，为理解 SMA 的发病机制提供了新的视角。此外，研究还强调了全长测序对于 SMA 诊断的重要性，尤其是在新生儿筛查日益普及的今天，开发能够补充 MLPA 方法的 SMN 测序技术至关重要。

不过，该研究也存在一定局限性。由于 SMN₁外显子 8 引物设计的原因，SMN₁外显子 8 缺失的病例被排除在分析之外，只能分析外显子 7 缺失的轻度病例。而且研究队列较小，且仅包含日本患者，结果是否适用于其他人群还需要进一步研究确认。但这并不影响该研究为 SMA 研究领域带来的重要价值，它为后续研究指明了方向，有望推动 SMA 诊断和治疗的进一步发展。**

研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：首先，采用 MLPA 方法对预先收集的基因组 DNA 样本进行初步分析，检测 SMN₁和 SMN₂基因的拷贝数及缺失情况；接着，使用改良的 LR-PCR 方法，以 KOD FX Neo 聚合酶特异性扩增 SMN₁基因包含外显子 1 - 8 的 28.2kb 区域；最后，对纯化的 LR-PCR 产物进行 NGS 测序，并利用相关软件进行变异注释和筛选。样本来源于东京女子医科大学临床确诊为 SMA 且提供了书面知情同意的患者。<