ATR-hippo 通路：机械转导与神经系统疾病关联的关键纽带

本文聚焦于机械信号如何通过细胞基质接触影响细胞命运这一谜题。研究发现 ATR 通过招募 Filamin-A 驱动核肌动蛋白（F-actin）组装，且 RASSF1 突变会导致核机械转导失效，引发大脑皮层变薄等问题，为探索复杂神经系统疾病机制提供关键线索。

引言

核膜（NE）是细胞感知细胞外机械力的关键部件，能将细胞骨架的信号传递至细胞核，影响细胞迁移、发育等过程，相关蛋白突变还会引发不良病理变化。共济失调毛细血管扩张症及 Rad3 相关蛋白（ATR）作为 DNA 损伤检查点激酶，对胚胎发育至关重要，其突变与塞克尔综合征相关，且能响应机械应力，与核膜关联。RASSF1A 是 ATR 底物，在河马（hippo）通路中起重要作用，参与调节机械传感器 yes 相关蛋白 / PDZ 结合基序（YAP/TAZ），还与核肌动蛋白的转运及转录有关。本研究揭示了在核膜处由机械诱导、不依赖 DNA 损伤反应（DDR）的 ATR - RASSF1A 信号级联，该级联可招募 Filamin-A，稳定核肌动蛋白丝。

ATR 诱导机械刺激下的核肌动蛋白聚合

实验采用直接机械单轴拉伸或渗透压应激来诱导核膜处的机械力。结果显示，ATR 与核膜内层蛋白 Lamin A/C 在核周共定位，且与 pRASSF1A 共定位。渗透压应激下，ATR 招募至核膜及 pRASSF1A 水平升高在 30 分钟内发生，ATR 抑制剂 VE - 821 可消除这种磷酸化，且该过程不依赖 DNA 损伤，因为实验中未观察到 γH2AX 积累。通过表达带有绿色荧光蛋白（GFP）标签和核定位信号（NLS）的肌动蛋白染色质体发现，机械力和高渗刺激可使核肌动蛋白以 ATR 依赖的方式聚合成丝状肌动蛋白（F-actin）。敲低 RASSF1A 或靶向 MST2 的 siRNA 处理会减少核肌动蛋白丝阳性细胞数量，这表明核 F-actin 丝可能由预先存在的单体核 G - 肌动蛋白形成。

Filamin-A 介导核 F-actin 的形成

对对照组和经山梨醇处理的 HeLa 细胞进行内源性 RASSF1A 免疫沉淀的质谱分析，发现渗透压条件下 Filamin-A 和 α- 肌动蛋白 4（ACTN4）特异性富集。通过共免疫沉淀（co-IP）证实了机械应激时 Filamin-A 和 ACTN4 与 RASSF1A 的相互作用增强。在 RASSF1A 的中央 RA 结构域中鉴定出典型的 Filamin-A 结合基序，预测其与已知底物 Migfilin 的结合方式相似。机械应激后，Filamin-A 与 Lamin A/C 共定位，且其招募依赖于 ATR 介导的 RASSF1A 磷酸化，ACTN4 则不与核膜关联。限制 Filamin-A 表达会减少机械力刺激下表现出核 F-actin 的细胞数量。

ATR - RASSF1A - 肌动蛋白的遗传破坏导致神经系统效应

Filamin-A 突变与 X 连锁遗传性脑室周围异位症等疾病相关。对大规模人类生物样本库的研究发现，ATR、RASSF1、ACTN4 和 MRTFA 的单核苷酸多态性（SNPs）与神经、体脂和癌症相关，其中 RASSF1 和 MRTFA 的多个 SNPs 与精神疾病相关，且相关基因变异与大脑皮层厚度变化有关。利用 PrecisionLife 平台分析发现，RASSF1 中的非编码 SNPs 和非同义 SNP（rs2073498）与神经质、认知下降和精神分裂症风险增加有关。

ATR - RASSF1A 调节神经元分化

此前研究表明 RASSF1A 促进胚胎干细胞（ESCs）向神经元谱系分化。在 H9 人胚胎干细胞（hESC）分化过程中，pRASSF1A 表达增加，且该过程依赖 ATR。在人神经祖细胞（hNSCs）分化过程中，ATR 和 RASSF1A 在核膜积累，pS131 - RASSF1A 水平升高。限制 RASSF1A 表达会影响神经胶质细胞（GFAP^+ve）和神经元（TUJI^+ve）的分化，减少微管稳定神经元分化标记物 MAP2 的表达。分析 rs2073498 发现，其与体脂和神经精神特征相关，携带该突变的个体脑区体积存在差异，如楔前叶体积减小。

Rassf1A^A133S/A133S小鼠模拟 rs2073498 对 ATR - RASSF1A - 肌动蛋白的影响

构建 Rassf1A^A133S小鼠模型，该小鼠出生时无明显发育缺陷，但随年龄增长会出现生殖器、肾脏和胰腺的囊性病变及癌细胞。A133S 替换不影响 RASSF1A 与核膜的结合及表达水平，但会导致小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在机械力刺激下招募 Filamin-A 至核膜的能力下降，无法形成稳定的核 F-actin。Rassf1A^A133S/A133S小鼠与人类 rs2073498 相关表型相似，如性腺脂肪增加、大脑皮层尺寸减小、特定脑区（PTLp）皮质深度降低、神经元数量减少和神经胶质细胞分布改变。

讨论

ATR 除了在 DNA 损伤修复中的作用外，还参与树突棘形成、突触活动和神经元可塑性调节，其功能缺失与多种神经系统疾病相关。机械力刺激可激活不同的机械感受通路，核 F-actin 的形成受多种因素诱导，其在细胞核功能和细胞命运决定中起重要作用。Filamin-A 对肌动蛋白丝的组织和稳定至关重要，其突变会影响神经元迁移和神经精神疾病发生。hippo 通路与精神疾病相关，RASSF1A 在该通路中起关键作用。本研究揭示的机械感受通路及 ATR - RASSF1A 的作用，为理解机械生物学和神经系统疾病机制提供了重要依据，也为研究胚胎发育和癌症转移中的机械转导过程提供了新方向。

材料和方法

1. 组织培养和细胞处理：HeLa 细胞、hESCs、ReNCell VM 等细胞的培养条件及处理方式，包括渗透压刺激、抑制剂使用、辐照处理等。
2. siRNA 寡核苷酸 / 质粒：RNA 干扰实验中使用的 siRNA 序列及转染方法，以及相关质粒的使用。
3. 抗体：实验中使用的多种抗体及其应用场景。
4. 蛋白质提取和免疫印迹：细胞胞质和核提取物的制备方法，以及免疫印迹的实验流程和数据分析方法。
5. 细胞核提取：HeLa 细胞核提取的具体步骤。
6. 免疫荧光：细胞和小鼠脑组织切片的免疫荧光染色及成像分析方法。
7. 免疫沉淀：细胞裂解物免疫沉淀实验的操作流程。
8. 底物拉伸系统：机械拉伸实验中使用的装置及实验方法。
9. 质谱分析：蛋白质免疫沉淀后的质谱分析流程及参数设置。
10. 数据分析：对质谱数据进行处理和分析的软件及方法。
11. 小鼠和组织制备：用于免疫染色的小鼠处理及组织切片制备方法。
12. 磁共振成像：小鼠脑部 MRI 成像及数据分析方法。
13. 定量和统计分析：使用的统计分析软件及统计检验方法，数据的表示方式及量化指标。