揭秘哺乳动物囊胚发育：细胞动态与细胞外基质如何塑造稳健组织模式

为解决哺乳动物胚胎发育中组织模式精准形成的难题，欧洲分子生物学实验室等的研究人员聚焦小鼠囊胚 ICM 展开研究。他们发现 PrE 和 EPI 细胞运动差异等关键机制，这对理解胚胎发育稳健性意义重大，推荐科研读者阅读。

在生命的奇妙旅程中，胚胎发育一直是科学家们热衷探索的神秘领域。组织模式形成（tissue patterning）在胚胎发育里起着关键作用，它协调着细胞的形态发生、动态变化以及命运抉择。就像搭建一座复杂的大厦，每个细胞都要找准自己的位置，发挥特定的功能，才能构建出一个完整且正常发育的胚胎。

然而，在哺乳动物胚胎发育过程中，一个令人困惑的问题始终困扰着科学家们：尽管胚胎发育存在着各种内在的变异性，比如早期小鼠胚胎在子宫内的大小差异可达四倍之多，但它们却能神奇地实现精确的组织模式形成，这背后的奥秘究竟是什么呢？在早期小鼠胚胎发育时，细胞命运的特化通常是由分泌的形态发生素和信号激活的基因调控网络来完成的，而细胞的行为，像分裂、迁移和分选等，则推动着形态发生，让组织在空间上有序排列。在这个过程中，全能细胞逐渐分化，形成各种不同的细胞群体。通过细胞的重排和分选，组织不断优化模式，形成清晰的边界，比如神经管、菱脑节、体节以及腺上皮和感觉上皮等结构。但命运特化、细胞动态变化以及它们内在的变异性，究竟是如何适应不断生长的组织大小和几何形状，从而实现稳健的模式形成的，依旧是个未解之谜。而且，早期哺乳动物胚胎缺乏像许多其他生物那样的形态发生素梯度或其他形式的预模式，这使得这个问题更加扑朔迷离。

为了揭开这个谜团，欧洲分子生物学实验室等机构的研究人员在《Nature Cell Biology》期刊上发表了题为 “Cell dynamics and extracellular matrix guide robust tissue patterning in the mammalian blastocyst” 的论文。他们发现，哺乳动物囊胚（blastocyst）能够通过细胞动态变化和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的相互作用，实现稳健的命运模式形成，而且内细胞团（inner cell mass，ICM）中胚层（epiblast，EPI）和原始内胚层（primitive endoderm，PrE）细胞的固定比例，是与胚胎大小和几何形状相适应的最优比例，这一发现为理解胚胎发育的稳健性提供了关键线索。

研究人员在这项研究中用到了多种技术方法。他们通过免疫外科手术（immunosurgery）分离出小鼠囊胚的 ICM，这样可以减少胚胎整体形状变化带来的干扰，方便观察细胞动态；运用活细胞成像技术，结合荧光报告基因，实时观察 ICM 细胞的运动和变化；利用微吸管 aspiration 技术测量细胞表面张力，了解细胞间的力学差异；还构建了 Poissonian 细胞 Potts 模型（CPM）进行计算模拟，从理论上探究细胞和 ECM 之间的相互作用机制。

下面来看看具体的研究结果。

不同的 EPI 和 PrE 细胞运动是 ICM 中细胞分选的基础

研究人员把 ICM 从整个囊胚中分离出来进行培养，就像把一个复杂的小世界单独拿出来观察一样。他们利用荧光报告基因标记 PrE 命运和普遍存在的 H2B - mCherry 报告基因，对分离的 ICM 进行实时成像，并通过自定义的半自动核检测和追踪程序进行定量分析。结果发现，EPI 细胞和 PrE 细胞在 ICM 中的运动方式截然不同。在分选早期，位于 ICM 表面的 EPI 细胞会迅速向内移动，而表面的 PrE 细胞并没有这种定向运动；并且，内部的 PrE 细胞向外运动的幅度比内部的 EPI 细胞更大。这就好比在一个大操场上，不同班级的学生有着不同的行动路线，EPI 细胞和 PrE 细胞按照各自独特的轨迹在 ICM 这个 “操场” 上移动，为后续的细胞分选奠定了基础。

顶端结构域降低表面张力，使 PrE 细胞定位在液体界面

为了更清楚地观察细胞形状的动态变化，研究人员构建了荧光嵌合 ICM。他们发现，有些细胞到达表面后会发生形状变化，变得扁平。通过对免疫染色的 ICM 进行分析，证实了这些扁平的细胞就是 PrE 细胞。进一步研究发现，EPI 细胞皮层中双磷酸化肌球蛋白调节轻链（ppMRLC）和肌动蛋白的积累更多，这表明 EPI 细胞的肌动球蛋白活性更高。通过微吸管 aspiration 直接测量 ICM - 液体界面的表面张力，发现细胞 - 液体界面张力与 Pdgfra^{H2B - GFP}强度呈负相关，也就是说 EPI 细胞在 ICM - 液体界面的界面张力比 PrE 细胞高。此外，免疫染色显示 aPKC 异构体定位于 PrE 细胞的无接触表面，而 EPI 细胞没有。研究人员通过构建荧光标记的野生型胚胎和缺乏 aPKC 异构体的胚胎嵌合体进行实验，结果发现，aPKC 敲除细胞大多聚集在 ICM 内部，而野生型细胞则更多地分布在表面。这一系列实验表明，PrE 细胞顶端极化（apical polarization）产生的较低界面张力，能够使其稳定地保留在 ICM 表面。

PrE 细胞的定向迁移依赖于肌动蛋白动力学和 RAC1

在 ICM 内部，PrE 细胞和 EPI 细胞的动态变化也有很大差异。研究人员构建了带有荧光标记的大的镶嵌囊胚，这样可以更清晰地观察细胞在完整囊胚环境中的运动。结果发现，PrE 细胞会朝着充满液体的腔室迁移，并且会伸出突起，而 EPI 细胞则留在 ICM 内。为了探究这种迁移的机制，研究人员进行了一系列实验。他们用 Latrunculin B 破坏肌动蛋白聚合，结果发现 EPI 和 PrE 之间的空间隔离明显减弱；用 CK - 666 抑制肌动蛋白分支，PrE 细胞就无法到达 ICM 表面；对 RAC1（一种对细胞迁移至关重要的小 GTP 酶）进行药理和基因扰动，PrE 细胞就不能正常迁移到 ICM 表面形成均匀的单层。这些实验充分说明，RAC1 活性和分支肌动蛋白介导的突起驱动了 PrE 细胞在 EPI/PrE 分选过程中向 ICM - 腔室界面的定向迁移。

PrE 细胞的顶端极性是定向迁移和分选所必需的

PrE 细胞中 RAC1 的激活和分支肌动蛋白网络的形成是怎么发生的呢？研究人员通过分析单细胞基因表达数据库，发现除了 Fgfr2，编码 ECM 成分的基因以及 PKCλ（Prkci）等在 PrE 细胞中特异性表达。免疫染色也证实了层粘连蛋白和 aPKC 在 PrE 细胞中密集积累，并且 aPKC 定位于迁移的 PrE 前体的前沿。通过测量 aPKC 在 PrE 细胞亚皮质区域的积累，发现 PrE 细胞在面向 ICM 表面的一侧 aPKC 分布存在差异，而且 GATA6 表达的 PrE 细胞比 EPI 细胞更极化，这种极化与细胞在 ICM 中的位置无关，说明 PrE 细胞是以细胞自主、命运依赖的方式获得顶端极性的。为了验证 aPKC 在 PrE 细胞迁移中的功能，研究人员用 Gö6983 抑制 aPKC 活性，结果 ICM 的分选和模式形成被破坏，PrE 细胞不再向囊胚腔延伸突起，细胞形状也变得更圆，与 EPI 细胞相似。同时，aPKC 异构体的基因敲除也导致 PrE 细胞无法正常迁移到腔表面，这表明功能性顶端极性对于 PrE 细胞的定向迁移和分选至关重要。

ECM 引导 PrE 细胞迁移

虽然知道了 PrE 细胞迁移和表面保留与顶端极性有关，但它们在 ICM 组织中如何定向迁移到 ICM 表面，尤其是向囊胚中的 ICM - 液体界面迁移，仍然不清楚。研究人员推测，PrE 细胞在腔附近的表面捕获可能会打破组织水平的对称性，导致 ECM 分布改变，从而引导后续的 PrE 细胞迁移。他们通过实验发现，活性整合素 β1 与层粘连蛋白在 PrE 细胞中共定位，表明存在活跃的细胞 - ECM 粘附，而且内部的 PrE 细胞会向已经到达腔表面的 PrE 细胞周围的层粘连蛋白延伸突起。通过计算模拟发现，在 EPI/PrE 分选过程中，ECM 会逐渐在 ICM 周边积累，尤其是在 PrE - EPI 界面处。免疫染色也证实了层粘连蛋白在 E3.75 时会形成向 ICM 表面增加的梯度。研究人员还通过植入层粘连蛋白包被的微珠和构建嵌合胚胎进行实验，结果都表明层粘连蛋白沉积能够引导 PrE 细胞迁移。综合这些结果，研究人员提出了一个 EPI/PrE 分选的机制模型：PrE 细胞获得顶端极性后产生突起和迁移活动，靠近腔的 PrE 细胞突起到达液体界面后被保留在表面，改变了 ECM 的分布，形成的 ECM 梯度又引导其他 PrE 细胞向腔迁移，这种 “面包屑导航” 机制实现了组织水平的对称性破缺和动态模式的形成。

固定的 EPI:PrE 细胞比例对 ICM 模式形成的精度提出挑战

在胚胎发育过程中，细胞命运的特化和模式形成之间的关系一直是研究的热点。之前有研究提出位置依赖的 PrE 命运特化，但这与 EPI:PrE 细胞比例固定的观点相矛盾。研究人员通过分析囊胚和 ICM 中 EPI:PrE 细胞的比例，发现其确实是固定的。通过细胞谱系追踪发现，在 EPI/PrE 分选过程中，位置依赖的命运转换对最终模式形成的贡献非常有限。为了进一步探究这个问题，研究人员对胚胎大小进行了操纵，结果发现，尽管胚胎大小变化很大，但 PrE 的比例始终保持恒定，而且在较大的胚胎中会出现异位的 PrE 细胞，较小的胚胎中则会出现异位的 EPI 细胞。研究人员还构建了带有 Myh9 杂合胚胎的嵌合囊胚，结果也支持了 EPI/PrE 细胞命运和比例在 ICM 模式形成过程中是固定的，没有可塑性的观点。

ICM 细胞组成对哺乳动物胚胎大小和几何形状具有适应性

固定的 EPI:PrE 比例和缺乏可塑性给早期哺乳动物胚胎实现精确的囊胚模式形成带来了挑战。研究人员通过对免疫染色的囊胚进行分析，发现大多数正常大小的胚胎，其 ICM - 腔界面面积在 PrE 细胞能够覆盖的范围内，有利于 PrE 单层的形成。通过计算不同大小胚胎中 PrE 单层形成的概率，发现正常大小胚胎中形成 PrE 单层的概率最高，而且在四倍大小差异的胚胎中，PrE 单层形成的概率都高于形成间隙或多层的概率，这表明 ICM 模式形成对胚胎大小的自然变异具有一定的稳健性。研究人员还对猴子和人类的囊胚进行了分析，发现猴子胚胎较大，ICM 中 PrE 细胞比例较高；人类囊胚更大，ICM 中 PrE 细胞比例较低。但无论是猴子还是人类的囊胚，其 ICM - 液体界面面积都在相应 PrE 细胞能够覆盖的范围内，这说明 ICM 细胞命运的最佳比例是物种特异性的，并且能够适应胚胎大小和组织几何形状。

总的来说，这项研究揭示了哺乳动物囊胚如何在不同大小和形状的情况下，维持稳健的命运模式形成。研究人员发现，ICM 内的组织水平对称性首先被 PrE 细胞在液体界面的保留打破，这是通过差异表面张力实现的。随后，PrE 细胞沉积的 ECM 在组织中形成梯度，这个梯度可能引导了 PrE 细胞的主动迁移，而 PrE 细胞的迁移则依赖于它们获得的顶端极性。尽管 EPI:PrE 细胞的比例是固定的，但这种比例是物种特异性的，并且与胚胎大小和几何形状相适应，使得胚胎在发育过程中能够克服自然大小变异，实现稳健的模式形成。

这项研究具有重要的意义。它首次详细揭示了 PrE 细胞经历 RAC1 依赖的主动迁移过程，并且发现了 PrE 细胞在 ICM 内的自主极化，这为理解细胞极性和细胞分选之间的功能联系提供了新的视角。研究提出的 “面包屑导航” 机制，为解释细胞在组织中的集体迁移提供了新的思路，也让我们对细胞 - ECM 相互作用在胚胎发育中的作用有了更深入的认识。此外，研究还发现细胞命运比例、细胞动态、分选持续时间、组织大小和几何形状等因素可能在进化过程中共同适应，以确保胚胎发育的稳健性，这为进一步研究胚胎发育的稳健性和进化机制提供了重要的线索。