在植物的奇妙世界里，有一种传统药用植物叫青风藤（Sinomenium acutum），它可是个 “宝藏植物”。青风藤属于木质藤本植物，生长周期比较长，大多在野外生长。它的藤蔓非常耐用，枝条又长又光滑，是编织各种器具的好材料，用它编织的传统手工艺品还被列为国家非物质文化遗产呢，每年的消耗量超过 100 万吨。不仅如此，它在医学上的价值更是不可小觑。在中医里，青风藤的干燥茎被用来缓解风湿疼痛已经有上千年的历史了；在现代医学中，它还被制成注射剂、缓释片等，用来治疗类风湿关节炎、慢性肾炎、痛风等疾病。
青风藤之所以有这么好的药用效果，主要是因为它含有结构多样的苄基异喹啉生物碱（BIAs），其中青藤碱（sinomenine）是最主要的活性成分。青藤碱属于吗啡烷生物碱，具有很强的抗炎、止痛和免疫抑制作用，在治疗类风湿关节炎的盐酸青藤碱制剂中广泛应用，总有效率高达 89.0%。除了青藤碱，青风藤里还含有其他 BIAs，比如具有抗 HIV 活性的（S）- 去甲乌药碱、有抗衰老等多种功能的原阿朴啡碱、能抗糖尿病的（S）- 木兰花碱，还有在缓解骨癌疼痛、抑制癌细胞方面有潜力的（S）- 延胡索乙素和（S）- 紫堇灵。
虽然科学家们在 BIAs 生物合成途径的研究上取得了一些进展，像吗啡、那可丁、罂粟碱这些重要分子的生物合成途径已经被完全阐明，还实现了异源生产。大多数 BIAs 通常以酪氨酸为起始前体，经过一系列复杂的反应，生成关键中间体（S）- 网脉番荔枝碱（（S）-reticuline） ，然后再通过细胞色素 P450（CYP450）、甲基转移酶、还原酶等基因的催化，形成不同骨架类型的 BIAs。但是，青风藤中一些生物碱，比如原阿朴啡碱、阿朴啡碱、吗啡啉生物碱的生物合成途径还不清楚，这些生物合成途径中关键酶的序列信息也不知道，这就像在黑暗中摸索，严重阻碍了这些具有药理活性化合物的合成和应用。而且，青风藤的基因组还没有被测序，遗传资源非常有限。
为了揭开青风藤中 BIAs 生物合成的神秘面纱，河南中医药大学的研究人员在《Scientific Reports》期刊上发表了一篇名为 “Metabolic profiling and transcriptome analysis of Sinomenium acutum provide insights into the biosynthesis of structurally diverse benzylisoquinoline alkaloids” 的论文。他们通过研究，提出了青藤碱的生物合成途径，还筛选出了 34 个可能参与其生物合成过程的关键候选基因，包括细胞色素 P450（CYP450s）、还原酶、2 - 氧戊二酸依赖的双加氧酶（2-ODDs）和 O - 甲基转移酶（O-MTs） ，为理解青风藤中结构多样的 BIAs 化合物的生物合成奠定了基础，也为未来研究功能遗传元件提供了重要线索。
在这项研究中，研究人员主要用到了转录组测序、代谢组学分析以及生物信息学分析这几个关键技术方法。转录组测序可以帮助他们获取青风藤茎和叶中的基因表达信息；代谢组学分析用于检测不同组织中的代谢物；生物信息学分析则对测序数据进行注释、筛选差异表达基因等，从而找到与 BIAs 生物合成相关的候选基因。
下面我们来详细看看研究结果：
- 青风藤的转录组测序和功能注释：研究人员从青风藤的茎和叶中提取 RNA，构建 cDNA 文库，然后用 BGI DNBSEQ-T7 高通量测序平台进行测序。经过筛选，得到了 255,571,722 条高质量的测序读长，测序质量非常高。由于青风藤没有基因组信息，他们用 Trinity 软件对这些读长进行组装，得到了 181,935 条转录本，进一步聚类去除冗余后，鉴定出 71,003 条单基因（unigenes） 。接着，他们用多个数据库对这些单基因进行注释，发现有 21,761 条（29.95%）至少在一个数据库中被注释。在 GO 分析中，很多单基因与 ATP 结合、金属离子结合等分子功能，以及转录调控、翻译等生物过程有关；KEGG 分析则表明，有 1,180 条单基因参与次生代谢产物的生物合成，其中 39 条与异喹啉生物碱的生物合成相关。这就像是在青风藤的基因世界里绘制了一幅详细的地图，让研究人员对它的基因功能有了初步的了解。
- 青风藤不同组织中代谢物的差异积累分析：研究人员用 UPLC-MS/MS 技术在正负离子模式下检测青风藤不同组织中的生物碱，一共鉴定出 295 种代谢物，并将它们分为 11 类，其中异喹啉生物碱最多，有 118 种。通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）发现，青风藤的叶和茎中的代谢物有明显差异，进一步比较发现，有 155 种代谢物在叶和茎中的含量差异显著，其中 69 种是异喹啉生物碱，而且这些异喹啉生物碱大多在茎中积累。不过，青藤碱的含量比较低，可能是因为组织中的含量本来就少，样本量也有限。后来用 UPLC-Q-TOF-MS 分析证实，青藤碱生物合成途径中的关键化合物，如（S）- 网脉番荔枝碱、青风藤碱等，在茎中的积累量更高。这就像发现了青风藤中代谢物分布的 “秘密基地”，茎似乎是 BIAs 的主要 “仓库”。
- 青风藤茎和叶中的差异表达基因：研究人员计算了单基因的表达水平（FPKM 值），发现茎和叶中有 5,795 个差异表达基因（DEGs），其中 2,375 个在茎中上调，3,420 个在叶中下调。对这些差异表达基因进行 GO 注释和 KEGG 通路分析后发现，它们与 DNA 结合转录因子活性、碳水化合物代谢过程等有关，还参与了植物激素信号转导、光合作用等途径。特别值得注意的是，在酪氨酸代谢和苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成途径中，分别有 21 个和 17 个差异表达基因，在异喹啉生物碱生物合成途径中有 11 个差异表达基因，这些基因可能都参与了 BIAs 的生物合成。这就像是找到了一些基因 “开关”，它们可能控制着青风藤中 BIAs 的合成。
- 青风藤活性化合物生物合成途径的候选基因筛选：研究人员根据转录组注释和差异基因表达分析，结合青藤碱的结构特点，筛选出了可能参与 BIAs 生物合成的候选基因。他们一共筛选出 53 个可能参与已知途径的基因，还有 60 个与下游 BIAs 合成相关的基因，比如与原阿朴啡碱、青风藤碱、粉防己碱合成相关的基因。通过分析这些基因在不同组织中的表达水平，发现它们存在组织特异性表达，这为进一步筛选关键候选基因提供了依据。就好像在众多基因中，找到了一些 “嫌疑最大” 的基因，它们很可能就是 BIAs 生物合成的关键参与者。
- 青藤碱生物合成下游候选 CYP450 基因的筛选和系统发育分析：青藤碱属于吗啡烷生物碱，目前对它上游生物合成步骤的研究比较多，但对下游合成过程还不太清楚。研究人员在青风藤的转录组数据中，只发现了一个注释为 CYP80G 的单基因 9141，而且它在不同组织中的表达没有明显差异。于是，他们扩大筛选范围，筛选出 105 个 CYP450 基因，经过分类和分析，确定了 12 个来自关键家族的 CYP450 基因，其中有 3 个在茎中高表达。他们推测，这 3 个基因和单基因 9141 可能是参与青藤碱骨架生物合成的重要候选基因。这就像是在基因的 “大海” 里捞出了几颗可能是 “宝藏” 的基因，等待进一步挖掘。
- 青藤碱生物合成下游候选还原酶基因的筛选：根据青藤碱的结构，从（S）- 网脉番荔枝碱转化为青藤碱可能需要还原酶的参与。研究人员筛选出 20 个还原酶基因，经过系统发育分析，发现大多数属于短链脱氢酶 / 还原酶（SDR）家族，只有 2 个属于醛酮还原酶（AKR）家族。进一步分析发现，有 10 个基因在茎中高表达，且都属于 SDR 家族，他们推测这些基因可能参与青藤碱的生物合成。这就像是找到了一些可能推动青藤碱合成的 “小齿轮”，它们在青藤碱的合成过程中可能发挥着重要作用。
- 青风藤碱生物合成下游候选 2-ODDs 的筛选：研究人员推测，青藤碱的转化过程中，C6 位点的去甲基化可能需要 2-ODDs 的参与。他们从转录组数据中筛选出 7 个 2-ODD 基因，经过分析，发现其中两个基因（unigene11331 和 unigene7147）可能是参与青藤碱生物合成的重要候选基因，而且有 4 个在茎中高表达的 2-ODDs 基因也可能参与其中。这就像是发现了青藤碱合成过程中的 “神秘助手”，它们的作用还有待进一步研究。
- 青风藤碱生物合成下游候选 O-MTs 的筛选：根据青藤碱的结构特点，最后一步可能需要 O-MTs 介导的甲基化反应。研究人员鉴定出 35 个可能的 O-MTs 基因，经过系统发育分析和表达分析，发现有 14 个在茎中高表达的 O-MTs 基因，特别是 unigene9784，可能在青藤碱生物合成的最后甲基化步骤中起关键作用。这就像是找到了青藤碱合成的 “最后一把钥匙”，它可能决定着青藤碱能否顺利合成。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员从青风藤中挖掘出了参与 BIAs 生物合成途径的候选基因，这对于理解青风藤的药用特性非常关键，也为青藤碱等活性成分的生物合成途径研究提供了重要线索，还为它们的异源合成提供了可能。通过转录组和代谢组的综合分析，他们发现了青藤碱可能的生物合成途径，并筛选出了一系列关键候选基因，这为后续验证基因功能、利用合成生物学技术生产青藤碱等活性成分奠定了坚实的基础。而且，这项研究采用的研究方法和思路，也能为其他药用植物活性成分的生物合成途径研究和基因筛选提供很好的参考，就像在植物研究的道路上点亮了一盏明灯，为后续的研究指引了方向。
生物通微信公众号
