猴痘病毒（Mpox virus，MPXV，曾用名猴痘病毒）是一种双链 DNA 病毒，属于正痘病毒属。它能感染人类，引发猴痘，症状包括发热、皮疹、淋巴结肿大和病变。此前，该病毒的传播主要局限于西非和中非。然而，自 2022 年 5 月起，MPXV（分支 IIb）已传播至 122 多个国家，规模空前。2024 年，由分支 Ib 的 MPXV 引起的猴痘在刚果民主共和国再次出现，并传播到非洲其他国家，仅在刚果民主共和国就造成了 4 万多病例和 1000 例相关死亡。2024 年 8 月 14 日，世界卫生组织宣布猴痘为国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC），这是过去两年中与猴痘相关的第二次 PHEIC。
猴痘的频繁爆发引发了全球的高度关注。由于天花病毒（VARV）已被消灭，可能对正痘病毒提供保护的疫苗接种计划也已停止。1980 年后出生的大多数人对 MPXV 没有免疫力。此外，近期数据显示，为治疗天花而开发的抗病毒药物特考韦瑞马特（tecovirimat），与安慰剂相比，未能缩短猴痘病变的持续时间（临床试验：NCT05559099）。因此，目前尚无在临床试验中被证明对猴痘有效的特定药物。而且，与早期毒株相比，引发 2022 - 2024 年疫情的 MPXV 毒株在与毒力、宿主识别和免疫逃逸相关的基因上携带多个突变，这表明 MPXV 正在加速进化。所以，更好地了解 MPXV 并确定潜在的药物靶点，对于控制由 MPXV 和其他正痘病毒引起的新兴公共卫生威胁至关重要。
MPXV 拥有非常大的基因组（长度约 200 千碱基对），编码约 200 种蛋白质。由于它仅在细胞质中复制，所以会编码对病毒复制至关重要的自身酶类。MPXV 编码的胸苷激酶（Thymidine Kinase，TK）是维持细胞脱氧胸苷三磷酸（dTTP）库、促进病毒 DNA 合成的关键酶。它在 dTTP 补救途径中发挥作用，MPXV 的 TK 将来源于降解的细胞或外源 DNA 的脱氧胸苷（dT）磷酸化，生成脱氧胸苷一磷酸（dTMP）。这个反应是 dTTP 生成过程中的限速步骤。通过维持细胞 dTTP 库并促进病毒 DNA 的高效合成，病毒 TK 有助于在宿主免疫系统能够有效防御之前建立感染。此外，病毒 DNA 的产生会使细胞 DNA 修复机制饱和，进一步削弱宿主控制病毒复制的能力。没有 TK 的 MPXV 已被证明存在显著的复制缺陷。
MPXV 的 TK 对于激活作为病毒 DNA 合成潜在抑制剂的胸苷类似物也至关重要。例如，5 - 碘 - 2'- 脱氧尿苷（5-iodo-2′-deoxyuridine，IDU），一种脱氧尿苷类似物，以及 N - 甲基碳环胸苷（(N)-MCT），一种构象锁定的核苷类似物，在体外都是牛痘病毒（vaccinia virus，VACV）的有效抑制剂，且细胞毒性较低。这些核苷酸类似物可能被病毒 TK 激活，并整合到新合成的 DNA 链中，从而终止病毒 DNA 的合成。此外，研究人员还发现了几种仅对感染 VACV 和牛痘病毒的细胞有毒性的胸苷类似物。这些在嘧啶环上含有大取代基的胸苷类似物，可被痘苗病毒 TK 选择性磷酸化，但不会被人类 TK 磷酸化，能够特异性地杀死被感染的细胞。尽管痘苗病毒 TK 在病毒复制和胸苷类似物激活中起着关键作用，但这种酶催化胸苷磷酸化反应的结构基础仍知之甚少。
在这项研究中，研究人员以 2.8Å 的分辨率测定了一种 MPXV TK 变体的晶体结构。结构分析显示，MPXV TK 由两个结构域组成，并形成四聚体。一个原聚体结合一个 dTTP 分子，而其他原聚体则以无配体形式捕获。结合结构分析和生化实验，研究人员确定了参与胸苷磷酸化反应的关键残基。结构分析还揭示了 MPXV 的 TK 与其他物种的 TK 之间的差异，这可能有助于开发针对这种重要酶的抑制剂，或开发可被 MPXV TK 选择性激活以消除被感染细胞的胸苷类似物。
MPXV TK（MPXV_USA_2022_MA001 分离株；GenBank 登录号：ON563414）的 DNA 由擎科生物优化合成。该序列被插入到 pET - 32M - 3C 质粒（由上海科技大学海涛阳实验室慷慨馈赠）的 BamHI 和 XhoI 限制酶切位点之间，用于表达带有 N 端硫氧还蛋白和 6xHis 标签的 MPXV TK 蛋白。研究人员还制备了编码含有特定氨基酸残基替换的 MPXV TK 变体的质粒。
为了解 MPXV TK 催化胸苷磷酸化反应的分子机制，研究人员着手测定 MPXV TK 的结构。野生型 MPXV TK 蛋白在尺寸排阻色谱（SEC）上于 14mL 处洗脱，这对应于 80kDa 的分子量，表明在溶液中为 MPXV TK 的四聚体。研究人员获得了野生型 MPXV TK 的晶体，但该晶体的衍射效果不佳，导致结构测定未成功。
在这项研究中，研究人员测定了在病毒 DNA 合成中起关键作用的 MPXV TK 的三维结构。研究人员发现 MPXV TK 形成四聚体。每个 TK 分子由一个 α/β 结构域和一个锌指结构域组成。活性位点位于这两个结构域之间。通过结构分析和生化实验，研究人员确定了参与底物结合和催化的重要氨基酸残基。这些结果为理解 MPXV TK 的作用机制提供了结构基础，也为开发针对 MPXV 的药物提供了潜在的靶点。
作者声明他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
研究人员感谢上海同步辐射光源（SSRF，中国）BL10U2 的工作人员，数据在那里收集。这项工作得到了中国国家自然科学基金（81902063，82202505）、重庆市科学技术委员会自然科学项目（CSTB2022NSCQ - BHX0679，CSTB2024NSCQ - MSX0391）、重庆市教育委员会科学技术研究项目（KJQN202300401，KJQN202300442，KJQN202400433）和 CQMU 的资助。
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