TAx9 技术：突破 Cre-loxP 系统构建难题，加速基因编辑研究进程

时间：2025年3月7日

来源：Communications Biology

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研究人员为解决 Cre-loxP 单质粒合成难题，开展 TAx9 相关研究，成功创建 F0 代转基因动物，意义重大。

开启基因编辑新征程：TAx9 技术的诞生

在生命科学的奇妙世界里，基因编辑技术宛如一把神奇的 “剪刀”，帮助科学家们探索生命的奥秘。其中，Cre-loxP 系统（一种用于在生物体内实现条件基因重组的强大工具）备受瞩目。它能让研究者根据 loxP 序列的方向，对生物基因组中特定 DNA 位点（floxed site）进行删除、倒置或易位操作，进而深入研究遗传、发育、生理和疾病等过程中的分子和细胞机制。比如，在研究基因功能时，科学家可以利用该系统精准地改变特定基因的状态，观察生物的变化。

然而，在利用 Cre-loxP 系统创建生物体的过程中，却遇到了一个棘手的问题。当试图创建同时含有 Cre 重组酶和 floxed site 的初始（F0）代生物体时，合成包含 Cre 基因和 floxed site 的单质粒困难重重。原因在于，当质粒在大肠杆菌细胞中扩增时，Cre 介导的重组会自发发生，导致 floxed site 从质粒中丢失。这不仅降低了 Cre-loxP 细胞或生物体的生产效率，还使得每次重复培养大肠杆菌时，重组质粒的积累会导致 Cre-loxP 单质粒的丢失。此前开发的 CREM 系统虽能在一定程度上解决问题，但因其依赖物种和细胞类型进行转录后调控，通用性不足，因此，科学家们急需寻找一种更有效的解决办法。

为了攻克这一难题，日本筑波大学（University of Tsukuba）的 Martin Miguel Casco - Robles、Tomoki Echigoya 等研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》上，为基因编辑领域带来了新的曙光。

研究 “利器”：关键技术方法

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术。在构建质粒时，通过标准分子克隆技术，对质粒进行改造和构建，以筛选保护 Cre-loxP 单质粒的 DNA 元件。在基因修饰方面，对于转基因蝾螈，采用 I-SceI 技术，将质粒 DNA 和 I-SceI 注入蝾螈受精卵；对于小鼠，则运用 CRISPR-Cas9 敲入（KI）技术，将构建好的质粒载体导入小鼠胚胎。此外，通过基因组 PCR 筛选含有完整转基因盒的个体，利用免疫组织化学分析检测目的蛋白的表达，这些技术共同助力研究的顺利开展。

研究成果大放异彩

TAx9：合成 Cre-loxP 单质粒的 “救星”研究人员通过对非洲爪蟾（Xenopus laevis）基因组区域的研究，发现了 TA/AT 重复 DNA 元件具有潜在的保护作用。经过筛选，他们发现 TAx9（一种人工核酸序列 TATATATATATATATATA）在大肠杆菌细胞中能有效阻止 Cre 介导的重组，是合成完整 Cre-loxP 单质粒的最优解决方案。实验中，研究人员设计了多种不同长度和方向的 TA 重复元件以及其他对照元件，将它们插入到特定质粒中进行测试。结果显示，TAx9 能完美地阻断 Cre 介导的重组，即使在培养大肠杆菌以获取足够数量的质粒后，仍能保持质粒的完整性。
TAx9 助力 F0 代 Cre-loxP 动物的创建
- 转基因蝾螈的成功创建：研究人员应用含有 TAx9 的质粒 pmCherry [EGFP]CreER^T2(I-SceI)，通过 I-SceI 技术创建了转基因红斑蝾螈（C. pyrrhogaster）。经过筛选，获得了 40 只在早期囊胚阶段（St. 10）和幼虫阶段（St. 43）表现出 EGFP⁺/mCherry^–的个体。在幼虫阶段（St. 59），用 4 - 羟基他莫昔芬（4-OHT）处理部分个体，结果在眼球的视网膜色素上皮（RPE）层检测到 mCherry 免疫反应性，而在其他眼部组织中未检测到，这表明 4-OHT 能诱导 RPE 细胞中 Cre 介导的重组，且 TAx9 未影响蝾螈的正常发育和生长。
- 转基因小鼠的成功构建：研究人员构建了含有 TAx9 的质粒 pmCherry [EGFP]CreER^T2(ROSA26 Arms)，利用 CRISPR-Cas9 KI 技术将其导入小鼠胚胎。通过对 79 只新生小鼠的筛选，最终获得 9 只在 ROSA26 位点携带完整转基因盒的个体，成功获得了 F0 代 Cre-loxP 小鼠。由于 F0 代个体数量有限，研究人员将 F0 代个体与野生型小鼠杂交获得 F1 代个体。对 F1 代个体的研究发现，他莫昔芬（tamoxifen）能诱导骨骼肌纤维（SMF）细胞中 floxed site 的重组，且重组概率随他莫昔芬剂量增加而增加，mCherry 在肌肉纤维中特异性表达。

研究结论与深远意义

研究人员成功发现了 TAx9 这一人工核酸序列，它能够有效解决在大肠杆菌细胞中合成 Cre-loxP 单质粒的难题，为创建 F0 代具有条件基因修饰能力的生物体提供了有力的技术支持。通过 TAx9 技术，研究人员成功创建了转基因蝾螈和 CRISPR-Cas9 敲入小鼠，且在这两种动物中，TAx9 均未影响正常发育和生长，同时能通过 4-OHT 或 tamoxifen 诱导目标细胞类型中的 Cre 介导重组。

对于蝾螈，F0 代个体可直接用于视网膜再生研究；对于小鼠，虽然在本研究中重组评估在 F1 代个体中进行，但 TAx9 技术有助于高效建立小鼠品系，避免了 Cre 和 loxP 盒分离的问题，且 Cre-loxP 盒位于单个位点便于品系维持。此外，TAx9 技术具有广泛的应用前景，原则上不仅可用于标准和诱导型 Cre-loxP 系统，还可应用于多种条件基因修饰工具，如 Flp-frt 和 Dre-rox 等。它能够与 RNA 干扰或 CRISPR-Cas9 基因组编辑工具相结合，实现对基因表达的时空特异性调控，包括基因过表达、基因敲低或基因敲除。这一技术的出现，有望加速生命科学各个领域的研究进程，为基因功能研究、疾病机制探索以及新型治疗方法的开发提供强大的助力，推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。