引言
铜绿假单胞菌是革兰氏阴性机会致病菌，在土壤、水等多种环境中存在，对公共健康威胁极大，尤其在医疗环境中，可定植于非生物表面和植入式医疗器械 。其具有多重耐药性，还能产生胞外毒力因子、次生代谢产物、毒素和生物膜，导致感染难以治疗，对囊性纤维化（CF）患者危害严重。
CF 患者因 CF 跨膜传导调节基因的遗传突变，氯离子通道功能缺失或部分缺失，黏膜清除功能不足，形成富含营养的环境，利于细菌生长。早期肺部感染多由金黄色葡萄球菌和流感嗜血杆菌引起，随着病情发展，铜绿假单胞菌逐渐成为主要病原体，常与洋葱伯克霍尔德菌共同定植，加重病情。
铜绿假单胞菌的毒力关键在于群体感应（QS）系统调控的胞外产物合成与释放。QS 是一种细胞间通讯机制，依赖自诱导物（AI）信号分子的产生、检测和群体响应，同时也依赖对关键调节蛋白稳定性的控制。大多数细胞内蛋白水解由保守的细菌 ATP 依赖蛋白酶启动，如 Lon、ClpAP、ClpXP 和 FtsH ，其中 Lon 蛋白酶由 N 端底物识别结合结构域和 C 端 AAA + 结构域组成，具有维持蛋白质质量控制和调节细胞过程的双重功能。
铜绿假单胞菌利用三个 QS 系统，其中两个依赖可扩散的 N - 酰基高丝氨酸内酯（AHL）信号分子。AHL 由 LuxI 合成酶催化产生，与 LuxR 型转录因子受体结合，稳定受体并调节基因表达，AHL 的产生和检测存在正反馈调节。铜绿假单胞菌的 LasR 和 RhlR 分别检测 N -（3 - 氧代十二烷酰基） - L - 高丝氨酸内酯（3OC12HSL）和 N - 丁酰基 - L - 高丝氨酸内酯（C4HSL）。第三个 QS 系统是假单胞菌喹诺酮系统（PQS），利用烷基 - 4 - 喹诺酮（AQs），如 2 - 庚基 - 3 - 羟基 - 4 - 喹诺酮（PQS）和 2 - 庚基 - 1H - 4 - 喹诺酮（HHQ），它们与 LysR 家族受体 PqsR 结合启动信号传导，PqsR 控制 pqsABCDE 表达，形成正反馈环。pqsABCDE 操纵子的最后一个基因 pqsE 编码一种硫酯酶，在 PQS 途径中水解 2 - 氨基苯甲酰乙酰辅酶 A（2 - ABA - CoA）为 2 - ABA，但在体内对 PQS 产生并非必需。
伯克霍尔德菌属与铜绿假单胞菌有相似的 QS 调控结构，利用 LuxI/LuxR 型 AHL 信号系统，如洋葱伯克霍尔德菌的 CepIR 系统。此外，伯克霍尔德菌基因组编码 pqsABCDE 操纵子的同源物 hhqABCDEFG，可产生 AQs，还能合成结构不同的 4 - 羟基 - 3 - 甲基 - 2 - 烷基喹啉。
研究发现 PqsE 主要通过与 RhlR 的物理相互作用调节 RhlR 依赖的转录，增强 RhlR 与启动子 DNA 的亲和力。RhlR、C4HSL 和 PqsE 共同协调绿脓菌素的产生，绿脓菌素常可在 CF 患者肺部检测到。RhlR 的转录激活依赖 C4HSL，PqsE 和 C4HSL 对 RhlR 启动子结合和基因调控影响不同，RhlR 启动子分为 C4HSL 和 PqsE 依赖两类。RhlR 和其他 LuxR 型受体有三种激活模式：配体依赖、配体和辅助蛋白依赖、配体非依赖和辅助蛋白依赖。Lon 蛋白酶可降解 QS 信号稳定和基因调控所需的特定蛋白，影响铜绿假单胞菌的 QS。
本研究旨在探索铜绿假单胞菌中 QS 辅助蛋白 PqsE 与其在伯克霍尔德菌属中的同源物 HhqE 的进化和功能保守性，为理解 QS 机制的特异性和进化提供新视角。
结果
- PqsE - RhlR 蛋白在革兰氏阴性菌中的分布：通过对革兰氏阴性菌基因组的靶向搜索，发现 PqsE 仅存在于铜绿假单胞菌中，在 728 种假单胞菌中，727 种含有 PqsE，且 650 种菌株的 PqsE 氨基酸序列 100% 相同，保守性极高。PqsE 同源物仅在伯克霍尔德菌属中被发现，其他属中搜索到的可能同源物因不在离散的生物合成基因操纵子中，且金属 β - 内酰胺酶折叠在不相关酶中普遍存在，故可能是功能不同的蛋白质。
构建的系统发育树显示，铜绿假单胞菌中的 PqsE 与伯克霍尔德菌属中的 HhqE 差异较大，氨基酸序列相似度仅约 30%。HhqE 在同一伯克霍尔德菌物种的不同菌株中高度保守，但在不同物种间存在差异。对 PqsE 和 HhqE 的保守性分析表明，它们的活性位点最保守，而 PqsE - RhlR 相互作用关键区域在不同物种间差异较大。
2. 伯克霍尔德菌 HhqE 缺乏同源二聚化和 RhlR 复合物组装的关键残基：已有研究表明 PqsE 二聚化对 PqsE - RhlR 复合物形成至关重要，特定精氨酸残基（R243/R246/R247）突变会破坏 PqsE 同源二聚化，影响绿脓菌素产生和 PqsE - RhlR 相互作用，但不影响其体外催化活性。
利用 AlphaFold - Multimer 预测伯克霍尔德菌中 HhqE 的结构，发现其与 PqsE 结构相似，但缺乏 PqsE 同源二聚化所需的关键残基，如 R243、R246、R247 和 E187。尺寸排阻色谱（SEC）和质谱光度法（MP）分析显示，PqsE 在高浓度下以二聚体形式存在，而 HhqE 在所有测试浓度下均为单体。
通过亲和纯化下拉分析发现，HhqE 不能与 RhlR 或其 “伙伴” LuxR 型受体 CepR 和 PmlR 相互作用，而 PqsE 能与 RhlR 相互作用。在绿脓菌素产生实验中，表达 PqsE 的菌株能够产生绿脓菌素，而 HhqE 无法互补 PqsE 的功能，不能促进绿脓菌素产生。
3. PqsE 二聚化以底物依赖的方式改变体外催化活性：PqsE 对合成底物具有可测量的体外酶活性，以 4 - 甲基伞形酮丁酸酯（MU - butyrate）为底物进行催化实验，发现野生型 PqsE 和 HhqEBc对其水解的亲和力和周转率不同。HhqEBc对 MU - butyrate 的结合亲和力更高，但催化效率低于 PqsE。利用不能二聚化的 PqsENI变体研究发现，单体形式的 PqsE 和 HhqEBc酶特异性（Kcat/Km）相当。
以乙酰乙酰辅酶 A（acetoacetyl - CoA）为底物进行实验，发现野生型 PqsE 和 HhqEBc对其水解效率不同，两者对该底物的结合亲和力均较弱，但周转率较高。这表明含有苯甲酸环的底物（如 MU - butyrate）可提高底物结合亲和力，而有效的底物周转仍需要 β - 酮硫酯。二聚化对催化的影响因底物而异，可能在底物特异性方面影响底物结合和周转。
4. RhlR 配体敏感性揭示对辅助蛋白的需求：大多数 LuxR 型受体在结合同源 AHL 配体时发生折叠，促进蛋白二聚化、溶解和 DNA 结合。通过蛋白质溶解性实验发现，RhlR 在仅诱导时添加 AHL 无法溶解，需在诱导和裂解时均添加 AHL 才能溶解；而 CepR 在诱导时添加中长链 AHL（C6HSL、C8HSL、C10HSL 和 3OC12HSL）即可溶解，且其同源配体 C8HSL 可使其溶解度最大。
利用大肠杆菌报告系统研究发现，C4HSL 和 C6HSL 可激活 RhlR 依赖的转录，PqsE 和 PqsEPf可增强这种激活作用，且呈剂量依赖性；而 HhqE 不能增强 RhlR 依赖的转录。CepR 对其同源配体 C8HSL 和 C10HSL 有响应，PqsE 或 HhqE 的存在不影响 CepR 依赖的转录。电泳迁移率变动分析（EMSA）表明，HhqE 不改变 CepR 与靶启动子的结合亲和力。
5. PqsE 在无 AHL 时防止 Lon 蛋白酶对 RhlR 的降解：RhlR 在表达时与 AHL 结合相对不溶，需在裂解缓冲液中添加过量 AHL 促进溶解。通过对不同基因背景的铜绿假单胞菌进行 Western blot 分析，发现缺乏 PqsE 或 PqsE 不能二聚化的菌株中，RhlR 水平显著降低，且 RhlI 合成的 C4HSL 对 RhlR 水平影响可忽略不计。构建缺失 Lon 蛋白酶基因的菌株发现，ΔlonΔpqsE 菌株中 RhlR 水平恢复到野生型水平，表明 PqsE 可保护 RhlR 免受 Lon 蛋白酶的降解。
讨论
本研究揭示了铜绿假单胞菌中 PqsE 与伯克霍尔德菌属 HhqE 的关键功能差异，主要源于 PqsE 独特的二聚化能力。PqsE 和 HhqE 的同源物仅在假单胞菌属和伯克霍尔德菌属中发现，其起源可能是水平基因转移或基因复制事件，随后发生分化和特化。PqsE 可能最初具有一般代谢或解毒功能，后被整合到 QS 系统中，在铜绿假单胞菌中与 RhlR 相互作用，而在伯克霍尔德菌属中不与 LuxR 型受体相互作用，这反映了两个属在生态和致病 niche 中的适应性差异。
PqsE 的二聚化对其在 RhlR 依赖转录中的调节作用至关重要，其在低浓度时可能主要作为单体发挥酶活性，高浓度时二聚化促进与 RhlR 的相互作用，增强毒力因子表达。而 HhqE 因缺乏二聚化能力，无法与 LuxR 型受体相互作用，在 QS 中的作用比 PqsE 更有限，伯克霍尔德菌属可能依赖其他机制进行 QS 和毒力调节。
铜绿假单胞菌的 QS 网络中，LasR 和 RhlR 在调节毒力和基因表达方面具有不同作用。LasR 在 QS 早期响应广泛信号，启动毒力基因表达；RhlR 在后期发挥作用，其活性受 PqsE 调节，这种分层安排确保了毒力因子产生的精确时间和协调。RhlR 激活需要较高浓度的 C4HSL，可能是为了确保在足够的细胞密度下表达相关特征，而 PqsE 的存在保护 RhlR 免受降解，促进其与启动子结合，驱动差异基因表达。
PqsE 在保护 RhlR 免受 Lon 蛋白酶降解方面起关键作用，影响 QS 进程。在高细胞密度（HCD）时，PqsE - RhlR 复合物促进毒力因子产生，同时保护 RhlR；随着细胞密度增加，PqsE 水平下降，RhlR 易被 Lon 蛋白酶降解，这可能在从 HCD 相关群体行为转变为低细胞密度（LCD）状态中起重要作用，类似于霍乱弧菌和创伤弧菌中调节蛋白的降解对 QS 系统的影响。进一步研究 Lon 蛋白酶对 RhlR 的调节机制，有助于深入理解 QS 下调的调控机制和铜绿假单胞菌的致病性。
材料和方法
- 菌株构建：采用传统 PCR 方法从洋葱伯克霍尔德菌（ATCC 25416）基因组 DNA 中扩增 hhqE 和 cepR 基因，从相关菌株的基因片段克隆其他同源物。通过 HiFi DNA 组装等方法构建 PA14 中 lon 基因的无标记框内染色体缺失菌株。
- 蛋白质生产和大规模亲和纯化：将 PqsE 变体和同源物基因克隆到 pET28b 载体中，在大肠杆菌 BL21（DE3）细胞中表达。过夜培养后稀释培养，达到一定 OD600值时用 IPTG 诱导表达，不同蛋白诱导条件不同。细胞裂解后，通过 Ni - NTA 树脂亲和纯化，再进行 SDS - PAGE 分析、浓缩，用于后续实验。CepR 表达和纯化采用类似方法，但使用不同载体和纯化柱。
- 尺寸排阻色谱分析：将亲和纯化后的浓缩蛋白注入 Superdex - 200 尺寸排阻色谱柱，通过与蛋白标准品的洗脱曲线比较，估计目标蛋白的分子量。
- 系统发育分析：利用假单胞菌基因组数据库和伯克霍尔德菌基因组数据库鉴定 PqsE 和 HhqE 的同源物，对序列进行比对、修剪，使用 IQ - TREE 生成最大似然树，选择合适的替代模型和自展支持值，用 Interactive Tree of Life 进行可视化和注释。
- 绿脓菌素测定：培养携带不同载体的铜绿假单胞菌 ΔpqsE 菌株，测量 OD600值后离心，测量细胞无细胞上清液在 OD695处的吸光度定量绿脓菌素，部分上清液用于超高效液相色谱 - 高分辨率质谱分析。
- 质谱光度法：使用 TwoMP 系统进行质谱光度法实验，样品经稀释后在特定条件下测量。对于 MassFluidix 实验，将蛋白配制成特定浓度，经快速稀释后测量，使用 DiscoveryMP 软件分析数据。
- 亲和纯化下拉实验：培养含有过表达载体的大肠杆菌菌株，诱导表达后收集细胞，裂解并离心，将含有 PqsE 或 RhlR 同源物的上清液按比例混合，与 Ni - 粒子磁珠孵育，洗涤后洗脱蛋白，进行 SDS - PAGE 凝胶电泳和染色成像。
- Western blot 分析：培养铜绿假单胞菌，收集细胞并裂解，测定蛋白浓度后进行 SDS - PAGE 凝胶电泳，将蛋白转移到膜上，依次用一抗、二抗孵育，洗涤后添加底物进行成像，使用 ImageJ 软件定量。
- 荧光素酶报告基因实验：按照之前描述的方法进行荧光素酶报告基因实验，分别构建表达 rhlR 和 cepR 的大肠杆菌报告菌株，在不同条件下培养，添加 AHL 诱导，测量荧光素酶活性。
- 催化活性和酶动力学测定：纯化 PqsE 或 HhqE 蛋白，分别以 MU - butyrate 和 acetoacetyl - CoA 为底物，在特定缓冲液中进行反应，使用酶标仪测量荧光或吸光度变化，用 Prism 10.2.3 软件计算周转数（Kcat）和米氏常数（Km）。
- 电泳迁移率变动分析：将 HhqE 和 CepR 蛋白稀释，与 cepI 启动子 DNA 混合，孵育后进行电泳，染色后成像分析。
- 蛋白质溶解性实验：培养转化有 RhlR 或 CepR 的大肠杆菌，诱导表达后收集细胞，裂解并分离全细胞裂解物和可溶性部分，进行 SDS - PAGE 凝胶电泳和染色成像。
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