基于免疫蛋白质组学筛选的P50蛋白间接ELISA技术开发及其在鸡滑液支原体抗体检测中的应用

时间：2025年5月7日

来源：Applied Microbiology and Biotechnology

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为解决鸡滑液支原体（Mycoplasma synoviae, MS）诊断技术特异性不足的问题，中国农业大学团队通过免疫沉淀联合质谱技术筛选出关键抗原P50蛋白，建立重组P50间接ELISA（rP50-ELISA）。该方法灵敏度达93%（95% CI=86.25-96.57%），特异性100%（95% CI=91.80-100%），与商用试剂盒符合率93.29%，为MS感染监测提供了高效工具。

鸡滑液支原体（Mycoplasma synoviae, MS）感染是家禽养殖业面临的重大挑战，可引发滑膜炎、气囊炎及蛋壳顶端异常等病症，造成严重经济损失。传统血清学检测方法如血凝抑制试验（HI）和血清平板凝集（SPA）存在灵敏度低或特异性不足的缺陷，而现有商品化ELISA试剂盒多基于变异较大的表面蛋白MSPB，易出现漏检。如何开发高特异性、广谱适用的诊断技术，成为MS防控的关键突破口。

中国农业大学兽医团队通过免疫沉淀联合液相色谱-质谱（LC-MS/MS）技术，从MS菌体蛋白中筛选出18个高评分抗原，其中分子量53 kDa的未表征蛋白P50因保守性强（序列同源性97.59-100%）、分泌特性显著被选为靶标。研究人员将P50基因克隆至pET28a载体，在大肠杆菌BL21中表达重组His-P50蛋白，经镍柱纯化后建立间接ELISA（rP50-ELISA）。关键技术包括：1）采用临床MS阳性鸡血清（n=100）和SPF鸡血清（n=43）进行免疫沉淀；2）通过FASP法处理样本后进行LC-MS/MS鉴定；3）优化ELISA条件（1 μg/mL包被浓度、1:200血清稀释度）；4）ROC曲线确定截断值（OD₄₅₀=0.1830）。

研究结果显示：
筛选MS主要抗原
免疫沉淀结合SDS-PAGE发现3条特异性条带，质谱鉴定出18个候选蛋白。点杂交证实重组P50蛋白能被MS阳性血清识别，而阴性对照无反应。

建立rP50-ELISA
ROC分析显示AUC达0.9979（95% CI=99.41-100%），灵敏度93%、特异性100%，显著优于基于MSPB的ELISA（AUC=0.9433）。

交叉反应验证
该检测对禽流感病毒（AIV-H5/H9）、新城疫病毒（NDV）等6种常见禽病原体抗体均无交叉反应。

临床样本验证
164份临床血清检测中，与商品化试剂盒符合率达93.29%（153/164），显著高于rMSPB-ELISA的60.37%。

该研究首次揭示P50蛋白作为MS诊断抗原的优越性：其保守序列克服了MSPB的株间变异缺陷，分泌特性保障了抗原可及性。建立的rP50-ELISA为MS净化计划提供了可靠工具，尤其适用于种鸡场监测。未来可进一步探索P50蛋白在MS致病机制中的作用，为多价疫苗开发提供新靶点。论文发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》，为兽医诊断领域提供了原创性技术方案。