FISHnet：解锁单细胞基因组折叠奥秘的新钥匙

时间：2025年5月13日

来源：Nature Methods

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在基因组研究中，单细胞层面检测染色质结构存在难题。研究人员开展 “FISHnet: detecting chromatin domains in single - cell sequential Oligopaints imaging data” 研究，开发 FISHnet 算法，能精准识别染色质结构，还发现单等位基因存在 TAD 和 subTAD 结构，为探究基因组功能提供新工具。

在基因组的奇妙世界里，科学家们一直致力于探索其复杂的结构与功能奥秘。随着研究的深入，人们发现哺乳动物基因组被折叠成多种复杂结构，如 A 和 B compartments、拓扑相关结构域（TADs）、亚拓扑相关结构域（subTADs）和环等。这些结构在基因表达调控中起着关键作用，例如 TADs 和 subTADs 及其边界能限制增强子与远端靶基因的相互作用，防止异位增强子 - 启动子相互作用，边界的破坏还与多种人类疾病中的基因表达失调相关。

然而，目前在单细胞层面检测这些结构仍面临诸多挑战。传统的基于批量测序的方法，如染色体构象捕获测序（Hi - C），虽然揭示了基因组的一些整体折叠模式，但无法在单细胞分辨率下精准观察这些结构。而新兴的多路复用连续 DNA FISH 寡核苷酸成像技术，虽能实现单等位基因成像，但在分析数据时困难重重。其数据的信噪比低，实验过程易出现大量数据缺失，且现有算法难以有效处理这些问题，导致在单细胞成像数据中检测类似结构的进展缓慢。

为了攻克这些难题，来自美国宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）的研究人员 Rohan Patel、Kenneth Pham、Harshini Chandrashekar 和 Jennifer E. Phillips - Cremins 开展了一项重要研究。他们开发了一种名为 FISHnet 的算法，相关成果发表在《Nature Methods》上。这一研究成果意义重大，为深入理解基因组的结构与功能关系打开了新的大门，有助于科学家进一步探究单等位基因折叠变异对基因组功能的影响。

研究人员在开展研究时，主要运用了以下关键技术方法：

构建模拟数据：利用已有的字符串和结合剂（SBS）模型模拟染色质折叠结构的成对距离矩阵，通过修改模型参数，创建具有不同特征的模拟数据，用于测试 FISHnet 算法的性能。
算法构建与优化：FISHnet 算法基于图论，包含阈值二值化、平滑处理、网络模块度最大化和共识分组四个关键步骤。通过调整多个参数，如平滑窗口大小、距离步长和平台大小等，优化算法性能，以适应不同的数据集。
统计分析：运用多种统计方法，如计算调整兰德指数（adjusted RAND score）来确定共识分区，进行卡方检验和置换检验以识别细胞类型特异性边界等，深入分析数据特征。
多数据集验证：使用多个已发表的 Oligopaints 数据集进行测试，包括来自不同细胞系和组织的样本，如人类 HCT116 细胞、小鼠胚胎干细胞（mESCs）、小鼠脑组织等，验证算法的有效性和通用性。

研究结果如下：

检测类似结构的准确性：FISHnet 在模拟和真实的单等位基因 Oligopaints 数据中，都能灵敏且特异地识别染色质结构域和边界。在模拟数据测试中，其受试者工作特征曲线下面积（AUC）达到 0.95，即使存在高达 40% 的数据缺失，AUC 仍能保持在 0.91，当使用线性插补处理缺失数据时，AUC 在数据缺失高达 80% 的情况下仍可达 0.88 。在与已有的绝缘分数方法对比中，FISHnet 在边界特征检测方面表现更优，能检测出嵌套的 TAD 或 subTAD 样结构及边界，而绝缘分数方法不具备此能力。
与已知数据的对应性：FISHnet 在真实数据中的边界识别结果与整体 Hi - C 数据中的 TAD 或 subTAD 边界高度对应。在对人类 HCT116 细胞和小鼠胚胎干细胞（mESCs）的研究中，FISHnet 识别的边界与整体 Hi - C 数据中的边界位置一致。在对果蝇胚胎高分辨率成像数据的分析中，也证实了 FISHnet 能准确识别明显的结构域。此外，在已知 TADs 和 subTADs 被破坏的扰动模型系统中，FISHnet 能再现由于黏连蛋白敲低导致的边界破坏模式。
检测单细胞异质性：FISHnet 能够检测原发性组织中单个细胞群体的结构域和边界位置差异。通过对小鼠脑组织中兴奋性神经元和小胶质细胞的研究，发现 FISHnet 可分辨同一细胞类型中单个等位基因边界位置的差异。通过统计检验，还能识别出在不同细胞类型中显著不同的边界，如在兴奋性神经元和小胶质细胞中，FISHnet 能识别出基因组位置上具有统计学意义的细胞类型特异性边界。
区分细胞类型：FISHnet 边界识别结果可用于区分不同细胞类型。对 IMR90、K562 和 A549 细胞的研究发现，基于 FISHnet 边界调用的主成分分析能够有效分离这些细胞系，而基于原始成对距离矩阵的主成分分析则无法区分。
发现层次结构：FISHnet 可检测到与整体 Hi - C 数据中最初检测到的嵌套 subTADs 一致的层次结构域。研究发现，通过调整 FISHnet 的距离阈值，可以检测到不同大小的 TAD 和 subTAD 样结构域。在不同细胞系中，FISHnet 域掩码计数与整体 Hi - C 数据具有很强的相关性，表明单等位基因成像数据中 FISHnet 域调用的频率可用于再现整体 Hi - C 数据中的 TADs 和 subTADs 。

研究结论和讨论部分表明，FISHnet 是一种强大的算法，为研究单细胞基因组折叠提供了重要工具。它克服了单细胞成像数据分析中的诸多技术挑战，能在不同分辨率和数据质量下有效检测染色质结构域和边界。此外，FISHnet 的应用揭示了单细胞间结构域定位的显著差异，为理解基因组折叠的机制提供了新视角。未来，研究人员计划进一步改进和扩展 FISHnet，以应对更大规模和更高噪声的数据，这将有助于更深入地探究基因组功能以及疾病发生发展的机制。