综述：利用液态一碳原料甲醇和甲酸盐通过产乙酸生物合成化学品和燃料

该综述聚焦产乙酸菌在循环碳经济中的应用，探讨其利用甲醇、甲酸盐等液态一碳原料通过伍德 - Ljungdahl 途径（WLP）合成化学品与燃料的潜力，涵盖代谢途径、生理特性、代谢工程及生物能量学等，展望其工业应用前景。

1. 引言

大气中二氧化碳（CO₂）浓度上升是全球变暖的直接原因，主要由人类社会大量使用化石燃料满足能源和物质需求所致。循环经济和可持续发展原则应用于碳经济，意味着不仅要减少排放，还需将碳作为循环生产线的核心，实现碳的利用、储存和再利用。工业生物技术可通过微生物和发酵技术提供替代方法，将其他行业的废弃物转化为有价值的产品。

一碳（C1）底物和含不同无机化合物的气体混合物（如甲烷、一氧化碳和氢气 / CO₂）作为微生物生长的替代原料，催生了第三代生物炼制厂。具有工业吸引力的气体发酵生物通常属于梭菌纲，如乙酰杆菌属、穆尔氏菌属、梭菌属等。然而，工业发酵中使用气体混合物存在技术限制，如气体向发酵液相的高转移速率需求，以及气体储存、运输和处理的挑战。相比之下，甲醇和甲酸盐等液态 C1 底物完全互溶，易于运输和储存。

甲醇是化学工业的重要组成部分，也被提议作为 “甲醇经济” 的关键原料。甲酸盐因成本较高，作为微生物发酵主要底物的研究较少，但随着技术发展，通过电化学或光化学从 CO₂和可再生能源合成甲醇和甲酸盐成为可能，以其为微生物原料的生物经济设计获得动力。

在已知的七种自然自养碳固定途径中，伍德 - Ljungdahl 途径（WLP）能量效率最高，不仅能将 CO₂，还能将其他 C1 底物（如 CO、甲酸盐、甲醇）转化为生物质和增值产品（如乙酸盐）。该途径在严格厌氧微生物中起作用，但高能量效率以总体 ATP 输出低为代价，限制了产乙酸菌的产品范围。

本综述讨论 WLP 如何实现甲基营养型和甲酸盐营养型生长，介绍产乙酸菌的生理学，强调生物加工的最新进展，讨论生理和代谢研究工具以及代谢和基因工程工具，分析生物能量学和化学计量学的特点和限制，并探讨该领域的未来前景。

2. 产乙酸菌中伍德 - Ljungdahl 途径的变体

WLP 的代谢中间体在 20 世纪 80 年代确定，在所有产乙酸菌中保守，但不同产乙酸菌的部分酶存在差异，决定了所需的特定氧化还原辅因子。除了广泛存在的 NADH 和 NADPH，产乙酸菌利用低电位电子载体铁氧还蛋白（Fd 或 Fd²⁻）驱动关键酶反应。

WLP 由两个分支组成，导致两分子 CO₂缩合为乙酰辅酶 A：羰基分支和甲基分支。甲基分支的第一步将 CO₂还原为甲酸盐，不同产乙酸菌使用不同的酶，如 NAD (P) H 依赖的甲酸脱氢酶（FDH）、与电子分叉氢化酶（FDH-Hyd）相关的甲酸脱氢酶或氢依赖的 CO₂还原酶（HDCR）。甲基分支随后通过一系列酶促反应生成甲基四氢叶酸（THF）。

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFRs）催化亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸，分为四类：细胞质 NADH 依赖型、Fd²⁻依赖型（可能是电子分叉的）和膜结合型（与分子氢反应）。羰基分支由乙酰辅酶 A 合酶（ACS/CODH）的 CO 脱氢酶活性介导，将 CO₂还原为 CO，甲基从甲基 THF 转移到载体，最终生成乙酰辅酶 A。

通过 WLP 生产一分子乙酰辅酶 A 需要一分子 ATP，产乙酸的典型主要终产物是乙酸盐，由乙酰辅酶 A 生成，通过底物水平磷酸化产生一分子 ATP，因此从 CO₂通过 WLP 形成乙酸盐是 ATP 中性的，净 ATP 生产需通过跨膜化学渗透机制。产乙酸菌中有两种已知的厌氧呼吸复合物：类红杆菌固氮（Rnf）和能量转换氢化酶（Ech），利用 Fd²⁻介导的电子转移驱动质子 / 钠离子跨膜转运。

部分产乙酸菌具有甲基和甲酸盐营养型生活方式，如 A. woodii 和 E. limosum 是研究甲醇和甲酸盐利用的模式生物。甲酸盐氧化为乙酰辅酶 A 提供电子，甲醇通过甲基转移酶系统进入 WLP，需要电子受体如甲酸盐或 CO₂。WLP 可作为代谢模块插入以固定 CO₂，甲醇同化途径由最小基因集编码，产品途径可通过代谢工程扩展。

3. 选定产乙酸菌的生理学和生物过程工程

3.1 伍氏乙酸杆菌（A. woodii）

A. woodii 是中温革兰氏阳性菌，是研究产乙酸菌的模式生物，能在多种有机底物上生长，也能利用分子氢自养生长，通过 WLP 同化多种 C1 底物。其发酵代谢的主要终产物是乙酸盐，也可产生少量乙醇和甲酸盐。

A. woodii 在甲酸盐和甲醇上的生长已被研究，转录组分析揭示了关键基因的作用，如甲酸转运蛋白 FdhC、甲酸 - THF 合成酶同工酶 Fhs1 和 Fhs2、HDCR 等。甲基转移酶系统基因簇在甲醇生长中上调，其缺失会消除甲基营养型生长。生物反应器中的连续培养研究显示了其在不同底物条件下的代谢性能和代谢灵活性。A. woodii 还可用于甲酸盐生产，作为全细胞生物催化剂实现氢的储存和 CO₂的捕获。

3.2 真杆菌属（Eubacterium spp）

真杆菌属包括多种能发酵 C1 底物生成乙酸盐和长链有机化合物的革兰氏阳性中温产乙酸菌。E. limosum 是该属的模式种，能在 minimal medium 上自养生长，其近缘种 E. callanderi 生理上与 E. limosum 高度相似。

E. limosum 在甲醇上的代谢响应显示丁酸盐生产与培养基中溶解的碳酸氢盐量相关，具有耐渗透性，混合营养生长时优先利用甲酸盐，可产生丁醇等。其产生的胞外聚合物赋予抗氧性和细胞外电子转移能力，基因敲除可改善处理和工程可用性。E. callanderi 在甲醇和合成气培养中可生产长链有机酸，赖氨酸添加可增强甲醇同化。

3.3 其他感兴趣的产乙酸菌

Eubacteriaceae sp. ES2 和 ES3 能高效将甲酸盐和甲醇转化为乙酸盐，ES2 是迄今已知效率最高的利用甲酸盐的产乙酸菌。卵形孢子菌（S. ovata）能代谢多种有机底物，包括甲酸盐和甲醇，也是电营养型生物，适合微生物电合成。luticellarii 梭菌从甲基营养型开放培养物中分离，能利用甲醇生产异丁酸等有机酸。热乙酸穆尔氏菌（M. thermoacetica）和 kivui 热厌氧杆菌（T. kivui）是高温产乙酸菌，适合生物加工，可降低冷却成本和污染风险。

4. 代谢工程和系统水平分析

开发基于产乙酸甲基营养型和甲酸盐营养型菌的可持续生物过程，需克服其 ATP 产量有限的限制，代谢工程可提高 ATP 产量并 redirect 碳和电子流。遗传工具的发展是代谢工程的前提，A. woodii、E. limosum 和 T. kivui 拥有较先进的遗传工具盒，包括复制质粒、CRISPR 编辑系统、荧光系统等。

A. woodii 的产品范围天然限于乙酸盐，但通过代谢工程已扩展到非天然化合物，如丁酸盐、丙酮、异丙醇、乳酸盐等。理性代谢工程还可提高底物摄取性能，如删除 CO 敏感的氢化酶基因可提高甲酸盐利用的生物量产量。Eubacterium spp. 自然能将甲醇 / 甲酸盐转化为多种产品，代谢工程可提高产品特异性，如丁醇生产。

对于遗传难处理的物种，适应性实验室进化（ALE）可促进菌株发展，如提高 S. ovata 和 E. limosum 在甲醇上的生长速率和甲醇耐受性。系统水平分析需要完整注释的基因组，基因组规模代谢模型（GSM）可预测代谢网络的扰动结果，结合组学数据可进行通量平衡分析（FBA）。组学数据在无 GSM 时也有价值，但产乙酸菌的代谢组学面临挑战，如氧敏感物质的定量和铁氧还蛋白的测量。¹³C 标记的代谢通量分析（MFA）在 C1 微生物中应用存在障碍，需特殊方法。

5. 甲基营养型和甲酸盐营养型生长过程中产乙酸的生物能量学

定量评估产乙酸菌将液态 C1 原料甲醇（+CO₂）和甲酸盐转化为增值产品的潜力，需考虑途径化学计量和生物能量学。化学计量学取决于底物和产品的性质，可用可用电子和还原度分析。甲酸盐转化为产品的碳效率随产品还原度增加而降低，甲醇转化的碳效率不依赖产品还原度，而取决于 CO₂的供应比例。混合供应甲醇和甲酸盐时，甲酸盐：甲醇比例与产品还原度相关。

生物能量学方面，产乙酸菌通过 WLP 代谢 C1 化合物，关键与铁氧还蛋白（Fd²⁻）的生成和利用有关，其低氧化还原电位有利于 ATP 生成。通过对 A. woodii 和 E. limosum 的建模分析，甲醇相比甲酸盐能产生更高的每摩尔乙酸盐 ATP 产量，不同底物和代谢背景下的可行场景比例不同。

改善生物能量学的策略包括改变关键酶的辅因子特异性，如用铁氧还蛋白依赖的甲酸脱氢酶（Fd-FDH）替代 A. woodii 中的 HDCR，可显著提高 ATP 产量，使更多产品途径可行。此外，改变丙酮酸形成反应从 PFOR 到 PFL 可能有益。

6. 结论

产乙酸菌因其高碳和能量效率以及与生长紧密耦合的产品形成，成为将甲醇和甲酸盐升级为增值产品的有吸引力的平台宿主。未来需要更深入理解产乙酸菌的甲醇和甲酸盐代谢，进行不同规模的生物加工以支持工艺优化和菌株开发，系统应用基因组编辑工具创造新菌株，探索合成共培养用于原料升级。推进生物加工策略可使甲醇和甲酸盐作为可再生原料、产乙酸菌作为生物催化剂在工业中应用，推动循环和可持续生物经济的发展。