综述：海洋脊椎动物食性DNA宏条形码技术综述——海龟摄食生态学研究的新前沿

本综述系统评述了DNA宏条形码（DNA metabarcoding）技术在海洋脊椎动物食性分析中的应用进展，重点探讨了该技术在海龟（sea turtles）摄食生态研究中的潜力。文章指出该技术能克服传统形态学方法的局限性，提高对易消化食物（如凝胶状生物gelatinous organisms）的鉴定能力，并通过多技术联用（如稳定同位素分析SIA）提升食性表征的全面性。

饮食表征的重要性

饮食表征对于理解动物在时空维度上的营养角色至关重要，特别是在应对气候变化的背景下。这促使饮食分析技术从古老的形态学胃容物分析发展到现代分子技术的广泛应用。鉴于对海洋动物进行直接分析的困难与局限，本文聚焦于基于DNA的海洋脊椎动物食性分析方法，梳理了过去二十年该领域研究的蓬勃发展。

饮食DNA宏条形码在海洋脊椎动物中的应用

什么是DNA宏条形码？

饮食DNA宏条形码是指从宿主生物获取可能含多种食物DNA的样本（如粪便、胃容物匀浆或拭子），提取DNA后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增，并利用高通量测序（HTS）技术进行测序，最后通过比对DNA条形码参考数据库进行物种鉴定。

该技术能有效提供短期食性组成信息，但其准确性受多种因素影响，包括条形码区域选择、引物设计、PCR条件、样本保存、DNA提取方法、生物信息学分析流程以及参考数据库的完整性。其他需注意的问题包括宿主DNA在PCR反应中的优势扩增、无法检测同种捕食（因猎物DNA与宿主DNA难以区分）以及难以区分主动摄食与二次或偶然摄入。

尽管如此，DNA宏条形码在许多生态学研究中的应用显示，其能提高物种鉴定的分辨率并揭示更高的多样性，特别是在与形态学或其他生物标志技术联用时。该技术已被认为是表征食性、构建生态网络和监测营养变化的有效途径。

过去二十年中，基于DNA的海洋脊椎动物食性研究显著增加，从简单的靶向PCR技术逐渐发展到基于高通量测序和生物信息学分析的宏条形码技术。目前，硬骨鱼类的相关研究最多（占85项宏条形码研究的36.5%），其次是海鸟（23.5%）和鳍足类（17.6%）。粪便和肠道样本占主导地位，而拭子取样在软骨鱼类和海龟等难以获取粪便的物种中也有应用。

何时DNA分析是最佳策略？

DNA宏条形码能改善传统方法中易被低估或遗漏的食物类群的鉴定。例如，该技术能更有效地检测凝胶状食物（如栉水母和刺胞动物），这些类群因易消化而难以通过形态学分析识别。然而，对于某些类群（如甲壳类、头足类、棘皮动物和环节动物），DNA宏条形码的灵敏度可能低于形态学方法，这与引物设计、DNA降解以及组织消化率有关。

缺乏预期食物类群可能是由于生态偏差所致。例如，一项研究发现海鸟 regurgitate 样本中检测到甲壳类DNA，但同种雏鸟粪便样本中未发现，这可能源于方法学限制或不同生命阶段的食性差异。因此，跨生命阶段、采样类型和消化道部位的比较显得尤为重要。

引物选择的重要性

引物选择需要在分类分辨率与扩增广度之间取得平衡。目标DNA片段需足够短，以适应降解的饮食DNA，同时又要包含足够的变异以实现高分类分辨率。简并引物可增加扩增范围，但扩增稳定性较差。参考数据库的覆盖范围因基因区域而异，目前最常用的引物集通常对应数据库覆盖最好的区域，便于与现有研究直接比较。

当前研究主要集中在肉食性海洋类群，而草食性或杂食性饮食的研究相对缺乏。对于杂食性饮食（包含植物、原生生物和动物物质），DNA宏条形码更具挑战性，可能受益于多基因座/多区域引物策略。类群特异性引物在特定研究中作用重要，但对于食性多样的类群（如某些海龟物种），通用引物可能更适用，以避免遗漏稀有或新颖食物成分。

阻断宿主DNA扩增

在饮食DNA宏条形码样本中，宿主DNA通常与饮食DNA共存，且浓度更高。通用引物可能扩增宿主DNA，导致测序读数中宿主序列占主导，从而减少可用数据。阻断宿主DNA的方法包括设计排除捕食者DNA的引物、限制性酶切、阻断引物和肽核酸钳（PNA clamps）。

阻断引物（基于DNA）和PNA钳（基于肽核酸）是两种常用方法。PNA钳具有更高的结合特异性和稳定性，能更有效地抑制宿主DNA扩增，但成本较高且优化复杂。选择是否阻断宿主DNA以及采用何种方法需根据研究预算、目标和具体条件决定。

二次/偶然捕食和同种捕食

区分主动摄食、猎物的食物、偶然摄入的生物以及附生生物是DNA宏条形码中的一个重要问题。例如，一项研究显示鲨鱼胃容物与其整个猎物的胃容物在分类组成上存在广泛混合。通过比较猎物与其潜在食物的共现情况，或比较消化道不同部位的样本，可最大程度地减少二次食物项的干扰。

然而，同种捕食的检测仍是一个未有效解决的问题。有效的阻断引物或其他宿主DNA阻断方法会阻止同种猎物的扩增，且当同种DNA存在时，无法区分来自宿主还是猎物。

获取定量饮食DNA数据的困难

评估食物的相对重要性、数量和大小是DNA宏条形码的一个关键局限。出现频率（%FOO）是DNA宏条形码可提供的关键指标之一，但仅能提供饮食成分的存在或缺失信息。相对读长丰度（RRA）允许通过序列读长的频率比较相对饮食类群丰度，但受序列回收偏差的影响较大。

定量能力预计将随着技术进步而提升，但目前仍需谨慎的实验设计来提供定量信息。

宏条形码可及性的障碍

成本是决定是否采用新技术的关键因素。DNA宏条形码作为分子技术，需要专门的实验室设备或外包给商业服务提供商。考虑一个基本的宏条形码流程，当前市场中每个样本的DNA提取、文库制备和测序成本约为35英镑。对于能使用内部测序平台的研究人员，成本可进一步降低。

生物信息学分析通常被认为是DNA宏条形码可及性的一个障碍，需要大量的时间、努力和编程能力。但随着生物信息学教学资源和预制流程的增多，内部分析正成为新研究者的可行选择。

海龟摄食生态学的机遇

海龟食性分析的演变

作为关键物种，海龟是生态工程师，在海洋食物网中占据重要地位。例如，绿海龟（Chelonia mydas）对海草的消费能显著影响海草的生产力和恢复力，而玳瑁（Eretmochelys imbricata）对海绵的摄食能缓解珊瑚的空间竞争。过去几十年，改进的食性分析表明海龟食性比最初认为的更多样。例如，绿海龟的食性随年龄和地点变化，动物物质（如水母、萨尔帕、鱼类和无脊椎动物）的摄入现已广泛报道。

传统上，海龟食性分析基于形态学鉴定，但多种局限意味着仅靠形态学可能无法提供全面的结果。通过将形态学技术与分子和生化方法结合，可以更全面地评估海龟食性。稳定同位素分析（SIA）在过去二十年中广泛应用，可提供长期、广泛的食性数据，帮助推断觅食区域和随时间变化的食性组成。

分子研究在海龟中的现状

DNA宏条形码已应用于海龟研究的多个方面，包括肠道微生物组、附生硅藻组合和食性分析。过去十年，海龟微生物组研究显著揭示了细菌群落与饮食之间的关联。例如，绿海龟的微生物群落在从野生杂食性转变为康复期草食性时发生变化，且绿海龟与肯普氏丽龟（Lepidochelys kempii）在同一地点显示出不同的微生物群落，这与它们的食性差异一致。

DNA条形码技术（对单个食物组织进行DNA提取、PCR和测序）在海龟中很少进行或报道，尽管它是肠道内容物分析研究中有用的补充工具。然而，该方法依赖于从肠道组织中获取DNA，因此受到通过尸检取样（可能缺乏野生种群代表性，样本量小）或食管/胃冲洗（侵入性程序，可能低估易消化食物组织）的局限。

目前，已发表的饮食宏条形码研究涉及两种海龟物种和两种采样方法。DNA宏条形码，特别是利用泄殖腔或食管拭子的研究，能够以相对非侵入性的方式增加取样，且只需较少培训，为获取海龟食性数据提供了新的机会。

拭子取样的使用

一小部分饮食宏条形码研究采用了食管或泄殖腔拭子取样。不同拭子部位提供不同的饮食视角：泄殖腔拭子可能由于某些食物更易消化而与食管拭子结果不同。食管样本可能提供近期消费的快照（可能由最近摄入的项目主导），而泄殖腔样本可能提供更长时间的整合饮食视图。

在通用引物结合下，拭子取样可能导致大量宿主DNA，可能受益于有效的宿主阻断机制。食管和泄殖腔拭子为评估活体海洋脊椎动物（如海龟）提供了一种相对非侵入性的方法。

理解凝胶状类群对海龟饮食的贡献

易消化的凝胶状生物在传统食性分析方法中难以识别。通过DNA宏条形码改进凝胶状生物的鉴定对海龟尤为重要。水母是海龟饮食的重要组成部分，最著名的是食凝胶质的棱皮龟（Dermochelys coriacea），但其他物种也有摄入。鉴于近期研究表明凝胶状类群可能对海洋营养系统的能量预算贡献超过先前认为，且形态学分析可能低估其饮食组成，我们可能低估了凝胶状生物对海龟饮食的贡献。这一假设得到同位素研究结果的支持。

此外，饮食中凝胶状成分的存在可能在环境变化驱动的凝胶状类群丰度和分布变化背景下具有重要影响。最近的生态系统模型表明，凝胶状类群对食物网的贡献可能特别容易受到海洋热浪的影响。因此，理解饮食中的凝胶状成分以及食物类群变化如何影响海龟食物可用性在未来几年将非常重要。

海龟长期食性研究的重要性

DNA宏条形码在应用于食性研究时具有实用优势，例如，能在最少田间时间内获取大量样本。个体发育变化是大多数海龟寿命的重要组成部分，使得长期食性监测对于理解其觅食生态尤为关键。虽然长期食性研究为海龟饮食提供了重要见解，但由于传统方法（如肠道内容物分析）的局限性，它们仍然罕见且逻辑上具有挑战性。

DNA宏条形码有潜力促进海龟饮食的长期监测，提供大量食性数据，从而实现跨生命阶段和个体发育变化、季节变化和可变环境的大规模比较。此外，DNA宏条形码有助于预测范围变化对营养系统的连锁影响。因此，饮食DNA宏条形码可能成为识别和监测保护海龟及其所依赖食物的关键区域的宝贵工具，为海洋保护区规划和保护政策提供信息。

分子食性分析的未来

随着分子技术成本的持续下降，考虑技术将如何演变以及不同方法对特定场景的适用性至关重要。诊断PCR和DNA条形码方法根据研究目标都可能具有优势。是否选择宏条形码应基于所提出的研究问题。例如，如果研究目的是识别宿主生物是否摄食特定物种，靶向方法可能足够。

宏条形码易受PCR偏差影响，可能导致特定饮食项的扩增失败或高估某些类群的重要性。宏基因组 protocols（其中所有DNA通过鸟枪法测序，无需PCR扩增）避免了PCR偏差，去除了选择引物的困难，因此也消除了引物偏差。虽然研究已开始探索宏基因组在食性分析中的一些成功应用，但它是否比宏条形码提供更好的信息仍有争议。

宏基因组饮食分析在海洋领域的探索较少，但一项评估两种河口海龙饮食竞争的研究发现，宏基因组识别出宏条形码分析遗漏的一个关键饮食类群，可能是扩增偏差的结果。宏基因组可能是海洋脊椎动物（包括海龟）饮食分析的一个重要方向，但它并非没有局限。与宏条形码一样，宏基因组依赖于已知的参考序列数据库（参考基因组），这些数据库更难开发。参考基因组数据库尚未足够丰富以提供跨类群的全面结果，且该技术目前非常昂贵，尽管这些局限可能随时间改善。宿主DNA偏差是宏条形码和宏基因组之间的一个共同问题，但在宏基因组中更难缓解。尽管消除PCR偏差很有吸引力，但基于PCR的方法可能仍然是处理降解DNA（因此也是饮食DNA）的最佳分子方法。

结论与未来方向

在进行食性分析时，分子技术（如DNA宏条形码）与替代技术（如形态学分析、稳定同位素分析）的组合可以揭示最多的信息。我们建议进一步实验DNA宏条形码，特别是从拭子中，可能提供一种时间高效、成本效益高、广泛的海龟食性取样手段。控制喂养研究和模拟群落分析实验可以提高结果的可信度，并更好地理解偏差，如饮食DNA降解的时间分辨率。

我们提出促进海龟饮食DNA宏条形码的五大研究优先事项：（1）针对不同海龟物种和生命阶段的稳健引物对推荐；（2）PCR中更有效的宿主DNA阻断；（3）更好地理解如何使宏条形码 protocols 适应杂食性饮食；（4）优化拭子 protocols；（5）增加生物信息学流程标准化，提高非专家的可及性。

DNA宏条形码可能成为回答关于海龟饮食一些悬而未决问题的关键驱动因素。通过识别更多凝胶状类群，它可能帮助我们理解凝胶状类群对除棱皮龟外其他海龟饮食的贡献。通过使我们能够识别广泛的饮食类群，它可能揭示海龟饮食中一些较稀有的成分，并发展我们对这些动物何时偏离草食性/肉食性的理解。通过实现大规模饮食分析，它可能鼓励随后跨海龟物种的全球饮食评论，并帮助我们回答这个问题：不同地点的海龟饮食有多大程度的变化？由于方法与肠道微生物组分析的兼容性，它可能帮助回答这个问题：饮食在多大程度上影响海龟的肠道微生物组？

全球海龟研究人员之间的合作，从康复中心到田间站点再到实验室，可能实现这一研究领域的快速有效进展。饮食DNA宏条形码可能促进海龟饮食及其营养相互作用的长期监测，以应对环境变化引起的波动，如迁移到替代觅食地、饮食组成变化以及食物类群丰度和分布的变化。