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本研究发现血清胱抑素S（Cystatin S, CST4）在化疗后结直肠癌（CRC）患者中显著高表达，其诊断性能（AUC=0.689）优于传统标志物CEA、CA125等。多模态诊断模型（CST4+CEA+CA125+CA724）显著提升检测效能（AUC=0.828）。机制研究证实CST4通过调控PDGFRB表达参与肿瘤微环境重塑，为CRC化疗后监测提供了新型生物标志物和潜在治疗靶点。
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症死亡原因。在中国，其年龄标准化发病率在过去十年中以每年4.8%的速度增长。尽管手术和化疗技术进步将局部CRC的5年生存率提高至65%，但约25%的患者初诊时已发生转移，凸显了可靠生物标志物对早期诊断和治疗监测的迫切需求。
当前筛查主要依赖粪便潜血试验和内镜检查，但侵入性和低依从性（<60%）限制了其应用。血清标志物如癌胚抗原（CEA）和糖类抗原（CA19-9、CA125）的敏感度（45-58%）和特异度（72-85%）有限，在化疗后监测中表现更差。
胱抑素超家族作为新兴肿瘤标志物备受关注。胱抑素S（CST4）是一种II型半胱氨酸蛋白酶抑制剂，通过调控细胞外基质重塑在肿瘤进展中发挥关键作用。初步蛋白质组学研究显示CST4在CRC组织中过表达，且其分泌特性允许无创血清检测，适合长期监测。然而，化疗对CST4表达的影响及其与传统标志物的协同价值尚不明确。
从TCGA-COADREAD（521例肿瘤 vs. 41例正常黏膜）和GEO数据集GSE39582（566例CRC患者）获取mRNA表达谱和临床数据。蛋白质表达数据来自人类蛋白质图谱（THPA），包括12例CRC标本和8例正常对照。
使用limma包处理标准化RNA-seq数据（FPKM值），并通过"survminer"包确定CST4表达的最佳分层截断值。采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验评估高低CST4表达组的总体生存差异。使用GSEA v4.3.2对Hallmark基因集进行富集分析，识别核心通路（NES>1.6, FDR q<0.05）。
回顾性收集2022年1月至2025年4月安徽医科大学附属巢湖医院81例接受化疗的CRC患者数据，包括年龄、性别、TNM分期和肿瘤标志物。其中男性54例，女性27例，平均年龄64±12岁。44例为TNM I+II期，37例为III+IV期。对照组为同期83例结直肠息肉患者，男性57例，女性26例，平均年龄62±5岁。所有诊断经结肠镜和病理检查确认，符合《中国结直肠癌诊疗指南（2023版）》和AJCC第八版TNM分期标准。
采集患者空腹血样（3 mL），使用凝血管室温孵育30分钟后，以3,000 rpm离心10分钟分离血清。采用商用ELISA试剂盒（上海领润生物科技有限公司，货号LR-ELISA-CST4-001）在Tethys 145自动分析仪上定量血清CST4水平。传统标志物CEA、CA125、CA153、CA199、AFP和CA724通过电化学发光免疫分析法在Abbott Alinity ci系列分析仪上测定。所有检测符合CLIA标准，批内变异系数<8%。
人结直肠癌细胞系HCT116（ATCC® CCL-247™）和正常结肠上皮细胞系CCD-841-CoN（ATCC® CRL-1790™）在标准条件下培养。HCT116使用McCoy’s 5A培养基，CCD-841-CoN使用DMEM培养基（Gibco），添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。细胞在37°C、5% CO2环境中培养，每3-4天传代一次，定期进行支原体检测和STR鉴定。
采用慢病毒介导的基因敲低建立稳定CST4沉默的HCT116细胞。设计三条靶向人CST4的shRNA（shCST4-#: 5’-GCAUCAAGUACAACCUGUA-3’）和乱序阴性对照shRNA（shNC），克隆到pLKO.1-puro载体中。通过Lipofectamine 3000共转染HEK293T细胞生产慢病毒颗粒，感染HCT116细胞（MOI=10）后用2 μg/mL嘌呤霉素筛选稳定转导细胞。
使用TRIzol™试剂提取总RNA，NanoDrop™ 2000验证纯度（A260/A280=1.8-2.0）。采用PrimeScript™ RT Master Mix合成cDNA，TB Green™ Premix Ex Taq™ II在QuantStudio™ 6 Flex系统上进行扩增。引物包括CST4（F: 5’-CCTCTGTGTACCCTGCTACTC-3’, R: 5’-CTTCGGTGGCCTTGTTGTACT-3’）、PDGFRB（F: 5’-AGCACCTTCGTTCTGACCTG-3’, R: 5’-TATTCTCCCGTGTCTAGCCCA-3’）和内参GAPDH（F: 5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’, R: 5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’）。数据通过2−ΔΔCt方法计算，以GAPDH归一化。
使用SPSS 26.0软件进行分析。正态分布分类数据用均值±标准差表示，非正态分布定量数据用中位数（四分位距）表示。组间比较采用Mann-Whitney U检验或t检验。通过二元Logistic回归分析影响因素，ROC曲线评估诊断性能，P<0.05为显著差异。体外实验数据以均值±标准误表示，采用非配对t检验。
TCGA数据集显示CRC组织中CST4 mRNA水平显著高于正常黏膜（P<0.001），GSE39582队列验证了这一结果（P<0.001）。Kaplan-Meier分析表明，高CST4表达患者总体生存较差（TCGA: P=0.017; GSE39582: P<0.001）。THPA的免疫组化证实CRC标本中CST4蛋白强烈表达，而正常组织几乎不表达，提示其可能参与肿瘤血管生成。
81例CRC患者和83例息肉对照组在年龄（64±12 vs. 62±5岁, P=0.118）和性别分布（男:女=54:27 vs. 57:26, P=0.783）上无显著差异。CRC组血清CST4水平显著高于对照组（中位数54.07 vs. 37.48 U/mL, P<0.01）。传统标志物中CEA、CA125和CA724也有显著差异（P<0.05），而AFP、CA199和CA153无差异。
CST4水平与年龄相关（>60岁患者更高，P=0.047），但与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移或TNM分期无显著关联（P>0.05）。性别间CST4水平也无差异（P=0.378），表明化疗可能调节CST4表达，独立于基线疾病严重程度。
多因素Logistic回归确认CST4是恶性肿瘤的独立预测因子（OR=1.027, 95%CI:1.012-1.043, P<0.001），预测能力优于CA125（OR=1.066, P=0.015），与CEA相当（OR=1.507, P=0.002）。CA724未达统计学意义（P=0.139）。模型显示良好校准（Hosmer-Lemeshow P=0.341）和区分度（C统计量=0.828）。
ROC分析显示CST4单独诊断AUC为0.689（95%CI:0.607-0.771），优于CEA（AUC=0.697）、CA724（AUC=0.608）和CA125（AUC=0.646）。CST4敏感度为45.7%，高于CA724（38.3%）。多标志物组合（CST4+CEA+CA125+CA724）显著提升诊断效能（AUC=0.828, 95%CI:0.766-0.891），敏感度增至74.1%，特异度81.93%，较单独CST4提高28.4%。
GSEA揭示CST4相关通路富集于细胞外基质（ECM）重组（NES=2.12, FDR q<0.001）、黏着斑信号（NES=1.98, FDR q=0.004）和癌症通路激活（NES=1.85, FDR q=0.012）。跨数据集验证识别PDGFRA和PDGFRB为CST4调控网络核心组分。PDGFRB在肿瘤组织中过表达（P<0.001），且与CST4转录水平强正相关（Spearman’s rho=0.64, P<0.001）。THPA证实CRC中PDGFRB蛋白高表达，生存分析显示高PDGFRB患者5年总体生存较差（HR=2.17, log-rank P=0.002）。
HCT116细胞中CST4和PDGFRB基础表达均高于正常结肠上皮细胞（P<0.001）。稳定转染CST4特异性shRNA显著降低CST4 mRNA（P<0.0001），并导致PDGFRB转录水平下降68.3%（P<0.0001），实验验证了CST4-PDGFRB调控轴。
胱抑素超家族含多个丝氨酸残基，在多种恶性肿瘤中过表达并参与肿瘤形成全过程。CST4作为低分子量分泌蛋白，通过特异性结合半胱氨酸蛋白酶调节其活性，防止细胞外基质水解。研究表明CST4与乳腺癌、食管癌和胃癌密切相关，刺激癌细胞增殖、侵袭和迁移，具备诊断、评估预后和复发的潜力。
结直肠癌早期常缺乏特异症状，患者多以血便为首发症状，确诊时已属晚期。中国早期患者诊断率仅15.2%（美国24.1%），早期发现和治疗仍是提高生存率和生活质量的关键。
本研究分析化疗后患者CST4水平与临床病理特征，发现除年龄外，CST4表达与T、N、M或TNM分期无关，可能因化疗显著降低CST4表达，导致不同分期患者水平无差异。CRC组CST4水平高于良性息肉组（P<0.05），表明即使治疗后，CRC组CST4水平仍较高，有助于区分良恶性疾病。未来需扩大样本量和多中心研究，收集治疗前CST4水平进一步分析。
传统胃肠肿瘤标志物（AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA724）对CRC诊断敏感度和特异度低，但常用于疾病筛查和复发监测。本研究显示CEA、CA724和CA125在两组间表达差异显著，Logistic回归确认CST4、CEA和CA125是CRC独立风险因素。CEA诊断CRC敏感度42%、特异度90.36%，优于CA125和CA724，仍是传统标志物中较准确者。CST4单独检测整体优于CEA、CA724和CA125，但单方面敏感度或特异度不理想，联合检测后两者均改善，诊断效能更高。
多组学分析发现CST4与PDGFRB表达显著相关，提示它们可能通过调控细胞外基质重塑参与CRC进展。血清CST4水平与PDGFRB表达强正相关（Spearman’s rho=0.42, P<0.001），表明协调调控机制可能驱动ECM重塑和肿瘤血管化。PDGFRB通过血小板衍生生长因子信号促进血管生成和基质活化，CST4则通过半胱氨酸蛋白酶抑制功能稳定肿瘤微环境。CST4表达的化疗耐药性（治疗后稳定CV=12.4%）提示该轴在治疗干预期间仍活跃，可能通过持续血管重塑导致治疗失败。
本研究局限性包括：首先，单独CST4检测AUC为0.689（敏感度45.7），早期诊断高敏感度临床需求难满足，支持联合检测必要性——本研究构建的CST4+CEA+CA125+CA724模型将敏感度提至74.1%，更符合"不漏诊"临床实践要求。未来需大样本验证模型稳定性，探索CST4与其他新兴标志物协同价值。其次，缺乏治疗前CST4测量，无法评估化疗诱导的生物标志物动力学及其与治疗反应相关性。第三，虽多模态模型改善敏感度，但需独立队列外部验证确认临床适用性。最后，CST4与PDGFRB关联仅为相关性分析，无功能验证，未来需动物模型阐明其间因果关系和分子机制。
本研究确立CST4作为CRC化疗后监测的稳健生物标志物。CST4在不同肿瘤分期和年龄组保持稳定区分能力，诊断性能优于CEA等传统标志物。CST4与CEA、CA724和CA125整合的多模态诊断模型显著提升检测能力，克服单标志物方法局限。机制上，体外实验证实CST4调控PDGFRB表达，CST4敲低导致HCT116细胞PDGFRB水平显著降低，验证CST4-PDGFRB轴作为细胞外基质重塑和肿瘤进展的关键信号通路，为CRC发病机制提供新见解。这些结果将CST4定位为化疗CRC患者治疗监测和复发检测的有前景候选者，有望解决当前治疗后监测策略的空白。
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