引言
梅花鹿（Cervus nippon）作为传统经济药用动物，其鹿茸富含多种生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松和促进伤口愈合等功效，因此在医药、营养保健品和皮肤化妆品领域应用广泛。鹿茸的 initiation 和 regeneration 受性激素和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）共同调控，而营养因素则 critically 决定了鹿茸生长 initiation 的时间精确性和周期性再生编程。虽然牛、羊等反刍动物的硒需求已有明确标准，但由于梅花鹿驯化历史较短，其最佳硒补充方案仍不明确。鉴于产茸鹿独特的营养需求，阐明硒对梅花鹿生长性能、养分代谢和鹿茸品质的影响对生产实践具有重要意义。
硒是动物生长必需的微量元素，缺乏会导致免疫失调、生长迟缓和繁殖功能障碍。在自然界中，硒主要以有机和无机形式存在，其中有机硒相较于无机类似物具有更高的生物利用度和较低的毒性。膳食有机硒补充可减少鹿组织中的重金属积累，同时增强全身抗氧化能力。
硒蛋白是一类含有硒代半胱氨酸（Sec）作为第21种氨基酸的蛋白质。GPX4是唯一能够还原大分子、结构复杂的脂质氢过氧化物的GPX酶，它保护脂质和生物膜免受氧化降解，并是铁死亡的关键调节因子。SELENOP主要在肝脏合成，通过SELENOP循环途径介导全身硒分布，同时发挥抗氧化作用。关键的是，梅花鹿在生茸期经历连续的生理挑战：鹿角桩脱落、快速伤口愈合、加速鹿茸再生。这些过程由于高代谢需求产生大量活性氧（ROS）。因此，强大的抗氧化和抗炎反应对于生产高质量鹿茸不可或缺。
本研究旨在评估梯度硒酵母补充对梅花鹿生产性能、养分表观消化率、血清抗氧化参数及鹿茸硒蛋白含量的影响，从而确定最佳膳食硒水平，为生茸期合理利用硒和生产富硒优质鹿茸提供科学依据。
材料与方法
动物与实验设计
选取20头健康、5岁、处于生茸期、体况相近的雄性梅花鹿，随机分为4组，每组5个重复，每个重复1头鹿。各组单独圈养。其中，SY1组为对照组，饲喂不额外添加硒的基础日粮。SY2、SY3和SY4组为实验组，在基础日粮基础上补充硒酵母（由郑州华丰食品技术有限公司提供，硒含量为2,300 mg/kg），硒添加水平分别为0.3、1.2和4.8 mg/kg。饲喂量根据梅花鹿不同时期的营养需要确定。实验期间，动物每日定时饲喂两次，自由饮水。所有动物操作均经青岛农业大学动物伦理委员会批准（批准号：DKY20240423）。
日粮
基础日粮根据NRC营养标准和梅花鹿的特殊需求，结合生产实践配制。基础日粮的组成和营养成分见表1。对照组和实验组的基础日粮营养含量一致。对照组不额外补充硒酵母，实测日粮硒含量为0.04 mg/kg。实验组在基础日粮上分别补充0.3、1.2和4.8 mg/kg的硒。
样品采集
在实验第1天和第60天早晨饲喂前，用盐酸赛拉嗪麻醉梅花鹿，测量体重，并由专业技术人员从颈静脉采集10 mL血液。血样在4,000 rpm下离心10分钟，血清分装于1.5 mL离心管中，于-80°C保存。从第30天起，连续三天在05:00至06:00之间每日采集粪便样品用于表观消化率分析，注意避免污染。
生长性能
在试验开始和采收二杠茸时记录体重。在早晨饲喂前禁食12小时后测量初始体重（IBW）和最终体重（FBW）。整个试验期间监测每头鹿的每日采食量和剩料。计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、干物质采食量（DMI）和料重比（F/G）。
鹿茸生产性能
在锯茸前，用软尺测量鹿茸尺寸。锯茸后记录鹿茸重量。所有数据为左右角平均值。测量角柄间距（用卡尺在皮肤水平测量角柄间距离）、角柄围长（角柄中部周长）、主干长度（从眉枝基部到顶端的自然长度，向后测量）、主干围长（主干中部最小周长）、眉枝长度（从眉枝基部到眉枝尖端的自然长度）和眉枝围长（眉枝中部周长）。测量精度记录到0.1 cm。
养分表观消化率
根据AOAC方法分析日粮和粪便中的干物质（DM）、粗蛋白（CP）、乙醚提取物（EE）、酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、磷（P）和钙（Ca）。
硒含量测定
使用根据AOAC方法制备的灰分溶液分析日粮、粪便和鹿茸组织中的微量元素浓度。随后通过原子荧光光谱法（AFS-9130，北京泰坦仪器有限公司，中国）测定硒含量。
血清抗氧化参数
使用商业试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，中国）测定血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，以及丙二醛（MDA）含量和总抗氧化能力（T-AOC）。
逆转录定量PCR（RT-qPCR）
使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）从约0.10 g各鹿茸组织切片中提取总RNA，操作按制造商说明进行。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定RNA浓度和纯度。使用PrimeScript™ RT试剂盒（Takara，日本）从1 μg总RNA合成第一链cDNA，操作按制造商方案进行。在ABI 7500实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上使用iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix（Bio-Rad，美国）进行RT-qPCR。使用OligoPerfect™ Designer（Thermo Fisher Scientific）基于NCBI数据库序列设计基因特异性引物；引物序列列于表2。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，使用2–ΔΔCt方法计算硒蛋白的相对mRNA表达水平。
蛋白质印迹分析
用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤组织样品两次，并在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中裂解。使用机械组织破碎器匀浆鹿茸组织层，匀浆液在4°C下12,000 rpm离心15分钟。收集上清液，使用Bradford法进行蛋白质定量。蛋白质在95°C变性5分钟后进行电泳。使用以下抗体进行蛋白质印迹分析：抗GAPDH（AB181603）、抗GPX4（AB231174）、抗SELENOP（AB193193）和山羊抗兔IgG二抗（AB205718）。使用UniProtKB验证蛋白质序列和分子量，所有抗体购自Abcam（英国剑桥）。
统计分析
所有统计分析使用SPSS 22.0进行。使用Shapiro–Wilk检验和Levene检验分别检验数据正态性和方差齐性。采用单因素方差分析（ANOVA）评估不同膳食硒酵母水平的影响，随后进行Duncan多重范围检验进行均值比较。数据以平均值±标准差表示。p < 0.05认为差异显著，p < 0.01认为差异极显著。
结果
生长性能
如表3所示，膳食硒补充水平对生茸期梅花鹿的ADG和DMI无显著影响（p > 0.05）。SY3组的F/G低于其他组，但差异不显著（p > 0.05）。组织硒存留量在SY2、SY3和SY4组之间存在显著差异（p < 0.01）。
鹿茸生产性能
如表4所示，膳食硒补充对梅花鹿鹿茸重量无显著影响（p > 0.05）。SY3组的平均鹿茸重量数值上高于SY1、SY2和SY4组；然而，这些差异无统计学意义（p > 0.05）。SY3组的所有鹿茸尺寸参数与其他组相比均显示出相似的非显著趋势（p > 0.05）。
养分表观消化率
如表5所示，SY2组的DM、Ca和P的表观消化率显著高于SY1和SY3组（p < 0.01）。同时，SY2组的DM和P消化率也高于SY4组（p < 0.05）。对于CP，SY2与SY1之间无显著差异（p > 0.05），而SY2显著高于SY3（p < 0.01）和SY4（p < 0.05）。SY2组的硒消化率高于SY3和SY4组（p < 0.01）。
血清抗氧化参数
如表6所示，SY4组的血清CAT活性显著高于对照组（p < 0.05）。SY2组的血清TrxR活性显著高于对照组（p < 0.05）。
鹿茸组织层硒含量
如图1所示，硒酵母对梅花鹿生茸期不同鹿茸组织层的硒含量无显著影响（p > 0.05）。
硒蛋白表达
如图2所示，在梅花鹿鹿茸的间质层，SY1组的GPX4 mRNA表达显著高于SY2、SY3和SY4组（p < 0.05）。在前软骨层和过渡层，SY1组的GPX4 mRNA表达显著高于SY4组（p < 0.05）。在间质层和前软骨层，SY3组的SELENOP mRNA表达显著高于SY1组，而在软骨层，SELENOP mRNA表达最高值出现在SY2组。
如图3和图4所示，除前软骨层外，SY2组在所有组织层中的GPX4蛋白表达均显著高于SY1组（p < 0.01），同时其在间质层和前软骨层的表达显著高于SY3和SY4组。对于SELENOP，SY3组在鹿茸各组织层中显示出最高的总体SELENOP表达（p < 0.01）。
讨论
有机硒在动物体内表现出比无机硒更高的生物利用度，能够更有效地沉积在母体组织中并随后转移给后代。在本试验中，膳食补充1.2 mg/kg硒的硒酵母降低了生茸期梅花鹿的F/G，而ADG随着硒水平的增加呈现二次响应。先前研究表明，硒能提高雌性梅花鹿的ADG和饲料效率。Jia等人在滩羊上的研究观察到硒酵母补充对ADG或ADFI无显著影响。Silva等人在牛和Liu等人在肉鸡上的研究也报告了一致的结果。在本研究中，生茸期梅花鹿的ADG和ADFI同样未发生显著变化，这可能归因于胴体性状的高遗传力，从而降低了对营养干预的响应性。
硒调节鹿茸生长，马鹿在生茸期的血清硒浓度高于其他生理阶段。硒富集 specifically 发生在鹿茸顶端，而鹿茸顶端是鹿茸发生的主要生长中心。硒蛋白可能调控睾酮生物合成和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）分泌。这些介质在骨膜内协同作用，促进骨骼生长、修复和代谢稳态。本研究观察到，补充1.2 mg/kg硒的梅花鹿，其鹿茸重量比SY1和SY2组增加了0.24 kg，比SY4组增加了0.37 kg。这与报道的硒诱导奶牛生产力增强一致，可能归因于硒减轻了氧化应激，从而改善了生理性能。尽管SY3组的鹿茸重量和尺寸数值上更高，但这些差异并不显著。梅花鹿营养研究中测量鹿茸产量和生理反应时也报告了类似的模式。此外，鹿茸生长受到组织特异性发育程序和内分泌状态的强烈影响，这在样本量有限的研究中可能掩盖处理效应。因此，在SY3组观察到的较高值应被视为观察趋势而非生物学效应的证据，需要在更大规模的试验中验证。
鹿茸生长动员大量的营养物质和矿物质元素从全身储备中支持快速组织发育。Bao等人证明，膳食补充0.3 mg/kg硒可显著提高梅花鹿CP和EE的表观消化率。类似地，硒羟基蛋氨酸可提高泌乳奶牛CP、NDF、ADF和硒的表观消化率，同时促进瘤胃发酵。本研究观察到，膳食补充0.3 mg/kg硒不同程度地提高了梅花鹿DM、CP、CF、Ca、P和Se的表观消化率。这种现象可能归因于硒诱导的胃肠道酶活性和瘤胃微生物结构的调节，从而将难消化营养物质转化为可吸收形式。关键的是，硒参与GPX的生物合成，保护消化器官免受ROS和自由基的侵害。这种保护作用增强了α-淀粉酶和蛋白酶的活性，最终改善了蛋白质和脂质的消化、吸收和利用。
本研究发现，梯度硒酵母补充对梅花鹿不同鹿茸组织层的硒含量无显著影响，但显著调节了血清抗氧化状态。这种现象可能源于硒在生物体内的重新分布，该元素被运输到氧化应激部位以维持全身硒稳态。GSH-Px降低细胞内过氧化氢水平，保护脂质、蛋白质和DNA免受氧化损伤，而TrxR通过生成还原型硫氧还蛋白来平衡细胞氧化还原状态。在马鹿中补充硒可显著提高血清和肝脏硒浓度。Mousaie等人证明，膳食硒酵母可提高羔羊血清T-AOC以及GSH-Px和SOD活性，同时降低MDA水平。类似地，Gong等人观察到，补充硒酵母的奶牛在产后7天和12天，血清GSH-Px、SOD和CAT活性增加，T-AOC改善。在本试验中，补充0.3 mg/kg硒显著增强了血清TrxR活性，并显示出提高GPX和CAT活性的趋势。这可能是通过硒整合到GSH-Px和TrxR的活性位点，从而激活抗氧化酶以减轻ROS诱导的损伤。在SY4组（4.8 mg/kg）观察到的有限响应可能反映了硒利用的生物学平台期，即当日粮硒超过需求时，不再进一步改善生产性能、抗氧化反应或硒蛋白合成。当硒摄入量超过功能需求时，反刍动物中也报告了类似的收益递减模式。另一种可能的解释是，过量的硒可能产生促氧化作用，即使以有机硒酵母形式提供。对牛和山羊的研究表明，高硒摄入会增加氧化应激标记物或降低抗氧化酶效率，表明在过量补充下从抗氧化活性转向促氧化活性。因此，SY4组的响应减弱可能是由于平台效应或早期促氧化压力所致，这可能部分抵消了预期的益处。
目前，在哺乳动物中已鉴定出25种硒蛋白，在我们初步（未发表）的研究中，在鹿茸中检测到13种硒蛋白，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）家族成员、硫氧还蛋白还原酶（TXNRD）家族成员和硒蛋白P（SELENOP）。本研究选择了两种具有多种功能活性的硒蛋白，GPX4和SELENOP，来研究膳食硒补充对其在鹿茸中含量的影响。在本研究中，膳食硒补充下调了GPX4基因表达，同时增强了鹿茸间质层、过渡层和软骨层中硒蛋白的丰度。GPX4蛋白的丰度受核因子E2相关因子2（Nrf2）通路转录调控。先前研究表明，GPX4经历多种影响其稳定性和催化活性的翻译后修饰（PTMs），表明有机硒可能通过调节PTM过程来改善GPX4的稳定性和抗氧化功能。在伤口愈合过程中，GPX4和SELENOP等硒蛋白在炎症阶段通过抑制促炎细胞因子反应和中和过氧亚硝酸盐自由基发挥关键作用，从而减轻氧化应激并促进组织修复。生茸期鹿茸的蛋白质组学分析显示，鹿茸顶端在脂质代谢、超氧自由基清除和谷胱甘肽代谢方面显著富集。在快速生长期，升高的细胞代谢触发ROS爆发，GPX4在保护鹿茸细胞免受氧化和自由基损伤方面起着关键作用。同时，硒补充显著增加了鹿茸中SELENOP的基因和蛋白表达。这可能归因于SELENOP作为硒转运蛋白的功能，当硒可用性增加时，促进硒的递送和硒蛋白的合成。在功能上，SELENOP通过其固有的谷胱甘肽过氧化物酶活性催化磷脂氢过氧化物降解，从而维持膜稳定性。在肝脏摄取后，硒被整合到SELENOP中用于向周围组织进行全身分布。关键的是，硒补充促进了鹿茸硒蛋白的合成，通过增强抗氧化能力优化了生物活性成分，从而为开发具有强化健康益处的增值鹿茸产品提供了理论基础。
结论
总之，膳食补充0.3 mg/kg硒酵母有效提高了梅花鹿的养分消化率和血清抗氧化能力。值得注意的是，0.3和1.2 mg/kg硒酵母均促进了鹿茸中硒蛋白的合成，从而生产出富硒的优质鹿茸。
