SH2scan检测平台的原理与化合物筛选流程
SH2结构域是识别磷酸酪氨酸（phosphotyrosine）模体的关键蛋白质相互作用（PPI）模块，但由于其结构保守性，开发高选择性抑制剂面临挑战。为解决缺乏大规模评估合成配体与SH2结构域结合选择性平台的问题，研究人员开发了SH2scan这一高通量、板式竞争结合检测平台。该平台涵盖了95个野生型SH2结构域构建体（包含97个SH2结构域，覆盖超过80%的靶点类别）以及7个突变型STAT SH2结构域构建体。
检测原理基于竞争结合：将含有SH2结构域的蛋白质构建体（与NFκB DNA结合域融合）与固定在磁珠上的捕获配体（磷酸肽）一起孵育。当存在竞争性化合物时，与磁珠结合的标记蛋白减少，通过苯基磷酸钠洗脱后，使用qPCR定量信号，从而计算出化合物与SH2结构域相互作用的解离常数（KD）。研究人员选取了9种来自文献的合成SH2结构域配体进行筛选，包括8种抑制剂/合成配体和1种蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC），例如靶向SRC家族SH2结构域的caffeic acid-pYEEIE、靶向GRB2 SH2结构域的CGP78850、靶向SOCS2 SH2结构域的MN551、靶向STAT3 SH2结构域的SI-109及其衍生的PROTAC分子SD-36、靶向STAT5B SH2结构域的Stafib-1，以及靶向STAT6 SH2结构域的STAT6-IN-1和STAT6-IN-3。
初步筛选与剂量反应验证揭示独特的结合选择性特征
初步筛选在10 μM浓度下进行，以≤35% DMSO对照信号作为命中标准。结果显示，不同化合物表现出迥异的结合选择性特征。例如，caffeic acid-pYEEIE显示出高度混杂的结合特性，与面板中71个（约70%）SH2结构域构建体结合，其中47个KD值在亚微摩尔范围内，对FYN SH2结构域的KD低至0.53 nM。相比之下，其类似物Ac-pYEEIE-NH2的结合谱则狭窄得多，仅与FES、FYN、PIK3R3（SH2dom.C-term.）和YES等少数几个结构域有微摩尔级的结合。
CGP78850对其主要靶点GRB2显示出3.4 nM的强结合力，同时也与GRAP（KD= 3.3 nM）和GRB7（KD= 5.2 nM）等密切相关结构域结合，并观察到与PIK3R1（SH2dom.C-term.）、PIK3R3（SH2dom.C-term.）、TNS1、TNS2、TNS3、TNS4、VAV1和VAV3等脱靶结合。
STAT3靶向配体SI-109和PROTAC分子SD-36均显示出对STAT3的最佳结合（KD分别为15 nM和21 nM），其选择性相对较窄，主要与其他STAT家族成员（STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6）有较低亲和力的结合，SD-36与SOCS4有微弱结合（KD= 5900 nM）。
SOCS2的共价配体MN551与其主要靶点结合KD为400 nM，但与SOCS4（KD= 64 nM）和CISH（KD= 46 nM）有相对较强的相互作用。
STAT6抑制剂STAT6-IN-1和STAT6-IN-3分别显示出0.68 nM和8.6 nM的强效靶向结合，并与其他STAT SH2结构域有较强亲和力。值得注意的是，两者均与SOCS4 SH2结构域有强效结合（KD分别为13 nM和10 nM）。STAT6-IN-1比STAT6-IN-3多出一个甲基，虽然其靶向效力更强，但选择性较差，额外与CBL、CRK、CSK等17个靶点存在弱结合。
STAT5B选择性抑制剂Stafib-1对其报告靶点的KD为1800 nM，并观察到对CISH、FER、PTPN6（SH2dom.N-term.）、SOCS4、STAT1、STAT2、STAT5A和STAT6等靶点的微摩尔级脱靶亲和力。
为验证SH2scan平台的特异性，研究人员测试了PTPN11（SHP2）的变构抑制剂JAB-3312和TNO155，两者在高达10 μM浓度下均未与PTPN11的任一SH2结构域构建体结合，表明它们不能竞争磷酸肽捕获配体的结合。该研究的假阳性率为3.8%，假阴性率为1.0%，证明了平台的稳健性。
讨论与结论
SH2scan平台成功揭示了测试化合物广泛的亲和力（皮摩尔到微摩尔级KD值）和不同的选择性特征。部分化合物（如SD-36、SI-109、MN551）选择性较窄，而另一些（如caffeic acid-pYEEIE、STAT6-IN-1、STAT6-IN-3）则表现出结合混杂性。所有9种化合物均显示出不同程度的脱靶结合。
研究不仅确认了文献报道的靶点结合，还发现了新的脱靶事件，例如STAT6抑制剂与SOCS4的强结合，这可能通过干扰JAK-STAT通路效应物的泛素-蛋白酶体系统抑制而影响其预期的抗炎效果。研究强调，在SH2结构域靶向化合物的结构-活性关系（SAR）优化过程中，即使微小的化学结构改变也可能对靶点类别内的结合亲和力和选择性产生深远影响，凸显了在药物发现早期阶段进行选择性筛选以规避潜在脱靶药理效应的重要性。
尽管研究试图覆盖所有120个典型SH2结构域，但部分靶点由于检测信号窗口不足或背景过高而未能成功开发。SH2scan平台为化学生物学社区提供了筛选化学物质以开发新型分子探针工具化合物的机会，可用于研究功能表征有限的SH2结构域蛋白，并可通过大规模分析感兴趣的蛋白质衍生磷酸肽来解析PPI网络。
实验部分
化合物与核酸：测试化合物购自MedChemExpress，磷酸肽由Biopeptide Co., Inc.定制合成，DNA探针由Thermo Fisher Scientific合成。所有化合物HPLC纯度 >95%。
蛋白质构建体与表达：SH2结构域构建体与NFκB DNA结合域融合，通过在HEK293细胞中瞬时转染表达。使用M-PER提取缓冲液制备蛋白提取物，并通过Western blot验证过表达。
竞争结合检测：将链霉亲和素包被的磁珠与生物素化的磷酸肽捕获配体孵育，然后与含有DNA标记的SH2结构域构建体的蛋白提取物及测试化合物在结合缓冲液中反应。孵育后洗涤磁珠，用苯基磷酸钠洗脱结合蛋白，并通过qPCR定量。通过优化捕获配体在磁珠上的负载百分比，确保测量的KD(app)接近真实的 thermodynamic KD。初步筛选使用10 μM化合物，命中化合物通过11点3倍系列稀释进行剂量反应验证以获取KD值。
曲线拟合：通过将数据拟合至Hill方程（Hill斜率设为-1）来计算KD值。
SH2结构域系统发育分析：基于人类SH2结构域序列，使用MUSCLE比对，GBlocks优化，RAxML软件构建系统发育树。
数据分析：通过计算信背比和Z分数评估检测质量。命中标准为≤35% DMSO对照信号百分比（POC）。系统发育树上的数据点通过Spotfire软件映射，点的大小与结合强度成正比。
总之，SH2scan作为一个可扩展的检测平台，既可用于开发靶向SH2结构域的新疗法，也可用于揭示新的PPI网络，在药物发现和化学生物学研究中具有重要应用前景。
