用于无创检测乳铁蛋白的电化学适配体传感器：阿尔茨海默病的潜在生物标志物

基于金丝印电极的乳铁蛋白aptasensor开发及其在阿尔茨海默病早期诊断中的应用

达米尼·维尔玛（Damini Verma）|阿迪·吉瓦拉杰（Aadi Jeevaraj）|B.S. 乌尼克里希南（B.S. Unnikrishnan）|德维什·比姆斯利亚（Devesh Bhimsaria）|戈皮纳特·帕基里萨米（Gopinath Packirisamy）

印度北方邦鲁尔基（Roorkee）印度理工学院（Indian Institute of Technology Roorkee）纳米技术中心，邮编247667

摘要

本文报道了一种可重复使用、无需标记、非侵入式且无需试剂的适配体传感器（aptasensor）的制备方法，该传感器能够直接通过电化学方法检测乳铁蛋白（lactoferrin, LF），乳铁蛋白是阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）的重要生物标志物。该传感器的制备过程包括将乳铁蛋白的巯基化适配体固定在金纳米印迹电极（AuSPE）上，随后填充6-巯基-1-己醇（6-Mercapto-1-hexanol, MCH）以形成MCH/Apt-LF/AuSPE适配体传感器。通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、动态光电压（DPV）、电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）等技术对传感器进行了表征。结果显示，该传感器在0.001至500 μg/mL的浓度范围内具有宽线性检测范围，灵敏度为13.072 μA [log₁₀ (μg/mL)]⁻¹ cm⁻²，检测限极低（0.0007 μg/mL），定量限为0.0024 μg/mL。该传感器对唾液中的多种干扰物质具有显著的选择性和重复性，能够快速、无需试剂地实现乳铁蛋白的检测，适用于阿尔茨海默病的评估。此外，对于添加了乳铁蛋白的人工唾液样本，其相对标准偏差（%RSD）低于8.88%。这一技术平台有望应用于其他神经退行性疾病的早期非侵入性诊断。

引言

阿尔茨海默病（AD）是影响老年人群的最常见神经退行性疾病。据世界卫生组织（WHO）预测，到2030年，AD患者人数将超过7800万，且发病年龄逐渐趋于年轻[1]。这一趋势对全球公共卫生系统构成严重威胁。生物标志物是临床前疾病的指示物[2]，对于开发改变疾病进程或预防性药物至关重要，因为AD的发病过程通常在临床症状出现前数年就已开始[3]。目前，用于早期诊断的生物标志物（如结构性和功能性磁共振成像[4]、脑脊液（CSF）中的β-淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白水平[5]，以及脑淀粉样蛋白成像或炎症老化检测[6]）由于成本、时间消耗或侵入性限制而应用受限。因此，人们正在努力尽快识别AD，以便开展改变疾病进程的药物研究。

乳铁蛋白（LF）是一种球形糖蛋白，属于转铁蛋白家族，存在于所有生物体液中（包括牛奶、眼泪、唾液和分泌物），分子量约为80 kDa[7]。即使在AD的早期阶段，唾液中的乳铁蛋白也被认为是潜在的生物标志物[8]。研究表明，AD患者的唾液乳铁蛋白水平较低（约4.78 μg/mL），而健康个体的水平约为10.24 μg/mL[7][9]。解释AD发病机制和发展的“脑-免疫相互作用”理论可能与AD患者唾液乳铁蛋白水平显著下降有关[10]。唾液乳铁蛋白主要来源于唾液腺的腺泡细胞和导管细胞，其分泌通过 constitutive 和 regulated 途径进行；后者在神经刺激或局部炎症信号的作用下增强[11]。此外，中性粒细胞在免疫反应过程中通过脱颗粒作用也参与唾液乳铁蛋白的分泌[11]。唾液乳铁蛋白水平与口腔免疫状态相关，在阿尔茨海默病早期阶段会下降，使其成为一种有前景的非侵入性早期检测生物标志物。与现有的Aβ42和脑脊液总tau蛋白检测方法相比，唾液乳铁蛋白可能是一种更可靠的AD诊断生物标志物[9]。已有多种方法（如仪器分析、反相高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳和免疫测定法）用于测定乳铁蛋白的含量[12][13]。这些方法的主要缺点是需要大型且昂贵的仪器（如GC-MS和HPLC），并且大多数传感系统操作复杂，需要专业技能[13]。因此，开发出快速、经济且易于使用的传感系统至关重要[14][15]。由于非侵入性生物液体检测可以降低疾病风险和损伤，这类方法比传统的抽血检查更受重视。基于唾液的非侵入性LF预测设备的开发有助于资源匮乏和资源丰富的地区都能获得平等的医疗保健服务[16]。近年来，电化学生物传感器在灵敏度、响应速度、经济性、微型化及易用性方面取得了显著进展[17][18]，特别是在床旁检测（POC）场景中，使用纳米印迹电极（SPE）的应用前景广阔[19]。

在过去十年中，适配体作为基于亲和力的生物传感器的生物受体，已成为抗体的极具潜力的替代品。适配体可通过指数富集（SELEX）从随机寡核苷酸库中系统地筛选获得[20][21]。由于其高特异性和亲和力、商业应用中的高重复性和纯度，以及开发生物应用时的高灵活性和稳定性，适配体被视为其他强效受体（如抗体）的有希望的替代品[22]。此外，直接使用适配体进行检测优于基于纳米材料的放大方法[23]，因为这种方法简化了传感器制备过程，减少了变异性，并实现了快速、无标记和低成本的检测，同时降低了表面修饰的需求，从而提高了重复性和POC适用性。

因此，我们开发了一种非侵入式、无需试剂、无标记的电化学适配体传感器，利用金（Au）纳米印迹电极表面的巯基化适配体直接检测唾液中的乳铁蛋白，随后用6-巯基-1-己醇（MCH）进行封闭。据我们所知，此前尚未有研究报道使用该传感器进行AD诊断的唾液乳铁蛋白检测。

材料

人乳铁蛋白重组蛋白（产品编号L1294）从印度Sigma Aldrich公司购买。DNA适配体序列（5’-GCAG GACA CCGT AACA CGGG CTTT TGCT TTAT CGTA CCCT TTAT GCTA GATT GTCC TGC -3’）由IDT公司按照Yu等人的方法合成[24]，并在5’端添加了巯基。商用AuSPE电极（250AT系列）从印度Metrohm DropSens公司购买。乳铁蛋白抗原溶液的浓度分别为0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL和500 μg/mL。

FESEM和FTIR分析

图1(a)显示了未固定前的Apt-LF的FTIR光谱。从图中可以看出，在2550 cm⁻¹处有一个弱的S–H伸缩峰，证实了5’端存在巯基。图1(b)展示了制备的电极Apt-LF/AuSPE和MCH/Apt-LF/AuSPE的FTIR光谱。Apt-LF/AuSPE光谱在969和1058 cm⁻¹处有峰值，分别对应DNA主链的P–O和糖–磷酸基团振动；1632 cm⁻¹处的峰为C=O伸缩峰。

结论

总结而言，本研究使用高效、无需试剂且非侵入性的适配体传感平台实现了阿尔茨海默病早期乳铁蛋白生物标志物的直接电化学检测。电极的修饰通过FTIR、FESEM、DPV、EIS和CV技术完成。所开发的适配体传感器具有高灵敏度（13.072 μA [log₁₀ (μg/mL)]⁻¹ cm⁻²，宽线性检测范围为0.001至500 μg/mL，定量限为0.0024 μg/mL，检测限为0.0007 μg/mL。

作者贡献声明

达米尼·维尔玛（Damini Verma）：撰写初稿、数据可视化、验证、项目管理、方法设计、实验研究、数据分析、概念构思。阿迪·吉瓦拉杰（Aadi Jeevaraj）：方法设计、实验研究、数据分析。B.S. 乌尼克里希南（B.S. Unnikrishnan）：撰写与编辑、方法设计、概念构思。德维什·比姆斯利亚（Devesh Bhimsaria）：撰写与编辑、项目监督、资源协调。戈皮纳特·帕基里萨米（Gopinath Packirisamy）：撰写与编辑、项目监督、资金管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

戈皮纳特·帕基里萨米（Gopinath Packirisamy）的研究得到了生物技术部（项目编号BT/PR49793/MED/32/856/2023）、Anusandhan国家研究基金会（CRG/2023/003549）以及ICMR-ICRC工作组项目（项目编号5/13/34/GP/ICRC/2022/NCQD-III）的支持。他还感谢印度政府生物技术部提供的TATA创新奖学金（HRD/16012/9/2024-HRD-DBT E-Camp，编号1996）。达米尼·维尔玛博士还获得了DBT BioCARe项目的支持。

达米尼·维尔玛博士目前是印度理工学院鲁尔基分校纳米技术中心的DBT BioCARe女性科学家，此前曾在该中心担任ICMR资助项目的研究科学家。她毕业于诺伊达的阿米蒂大学（Amity University），并与新德里的贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学（Jawaharlal Nehru University）纳米科学特别中心合作获得博士学位。她还在昌迪加尔（Chandigarh）的M.C.M.D.A.V.女子学院获得学士学位和硕士学位。