2024年，一场前所未有的H5N1高致病性禽流感疫情在美国奶牛群中暴发，随后病毒传播至家禽、野生鸟类和其他哺乳动物包括人类。这一异常情况引起了科学界的广泛关注：原本主要感染鸟类的禽流感病毒是如何快速适应这种新型哺乳动物宿主的？为了解答这一关键问题，由Vidhi Dholakia、Jessica L. Quantrill、Samuel A. S. Richardson等研究人员组成的国际团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。
传统上，流感A型病毒的自然宿主是野生水禽和滨鸟。然而，病毒能够溢出并适应感染哺乳动物物种，如猪、人类、马和狗。自2020年以来，H5N1分支2.3.4.4b的一种新基因型在欧洲出现并在全球传播，引起了鸟类中的泛动物流行病。这次疫情的特殊之处在于病毒频繁溢出到哺乳动物中，包括在养殖水貂、海洋哺乳动物以及最近的奶牛中确认或潜在的哺乳动物间传播。
感染奶牛的这种B3.13基因型H5N1病毒并不导致奶牛高死亡率，而主要引起乳腺炎和轻微的呼吸道症状。但令人担忧的是，病毒在感染奶牛的乳腺中复制极为活跃，乳汁中含有高滴度的感染性病毒。更重要的是，除了奶牛，多种其他物种也因直接或间接接触感染奶牛而被感染，包括鸡、火鸡、家养猫和人类。接触感染牛奶的猫科动物感染多次致命，而在人类中，B3.13病毒则与结膜炎和/或轻度呼吸道疾病相关。
禽流感病毒通常在哺乳动物宿主中的复制受限，但它们能迅速积累哺乳动物适应性突变来克服这一障碍，这些突变通常出现在病毒RNA依赖性RNA聚合酶中。特别是，ANP32蛋白是病毒支持基因组复制所必需的重要宿主编码因子。禽源流感病毒需要聚合酶突变才能利用较短的哺乳动物ANP32A/B蛋白。最广泛和最特征明确的适应性突变是聚合酶PB2亚基中的突变，包括PB2 E627K、Q591R/K和D701N，这些突变在其他哺乳动物H5N1疫情中均被检测到，但在最初的奶牛病毒中缺失。
为了理解禽流感病毒如何适应在新哺乳动物物种细胞中有效复制，研究人员首先构建了所有从奶牛分离的流感A病毒、首例报告人类病例病毒以及2023年9月至2024年3月野生禽类病毒的连接基因组的系统发育树。来自奶牛的病毒形成一个单系群，表明是从野生鸟类的一次溢出事件。系统发育分析强烈表明M631L是在奶牛中进化的，尽管有一小部分可能性是它在传入奶牛之前已在鸟类中出现。
通过构建适合在牛细胞中测试禽流感病毒聚合酶活性的"微型基因组"系统，研究人员发现德州奶牛病毒的重构聚合酶复合物在MAC-T牛乳腺上皮细胞中高度活跃。当他们重构一个类禽祖先代表最可能进入牛群的病毒的聚合酶复合物时，发现类禽祖先聚合酶的活性远低于野生型德州奶牛病毒。进一步分析确定，PB2 M631L将活性提高了约10倍，表明这是H5N1适应奶牛早期出现的关键聚合酶突变。
大多数牛序列中含有PA K497R，研究人员发现这一突变在缺乏M631L时也能增加聚合酶活性，并增强病毒在牛乳腺细胞中的复制。重要的是，这些突变对人类细胞也显示出相似的增强效果，表明它们可能是跨哺乳动物物种的通用适应性突变。
为了在分子水平上理解这些适应性突变的机制，研究人员将PB2残基631定位到流感聚合酶与宿主因子ANP32的界面附近，靠近其他几个哺乳动物ANP32适应性突变，如PB2 E627K和Q591R。他们假设B3.13聚合酶通过提高其利用牛ANP32蛋白的能力而适应牛细胞。实验证实，牛ANP32A始终比牛ANP32B能更好地支持所有测试组合的聚合酶活性。分裂荧光素酶实验进一步证明，奶牛病毒中的聚合酶突变显著增强了聚合酶与牛和人类ANP32A/B的相互作用能力，与牛ANP32A的相互作用更强。
随着疫情持续，研究人员在牛病毒聚合酶基因中检测到进一步已知哺乳动物适应性的出现，包括PB2 Q591R、至少三个独立出现的PB2 D740N，以及2025年更近的一个含有PB2 E627K的集群。引入PB2 D740N显著提高了牛、人和猪细胞中的聚合酶活性，而引入PB2 E627K则导致最高的聚合酶活性。
关键技术方法
本研究主要运用了系统发育分析追溯病毒进化路径；物种特异性微型基因组报告系统评估聚合酶活性；反向遗传学技术拯救特定突变病毒；体外感染实验评估病毒在牛乳腺组织外植体、多种哺乳动物和禽类细胞系以及原代人类鼻上皮细胞中的复制动力学；ANP32蛋白互补实验和分裂荧光素酶结合 assay 解析宿主因子相互作用机制。牛乳腺外植体来源于健康泌乳牛，原代人类鼻上皮细胞来自3名成人捐赠者。
PB2 M631L和PA K497R使牛H5N1在哺乳动物细胞和外植体中有效复制
为了进一步测试PB2 M631L和PA K497R在适应病毒在哺乳动物细胞中复制的重要性，研究人员为德州奶牛病毒构建了反向遗传学系统，并制备了在这些位点携带突变的病毒。在牛体外乳腺外植体中，与最小类禽前体病毒相比，单独含有PB2 M631L或与PA K497R组合的病毒在24和48小时显示感染性病毒滴度显著增加超过10倍。在MAC-T细胞和牛肺泡细胞中，PB2 M631L而非PA K497R单独在多个测试时间点显著增强复制。在几个人类肺细胞系中，PB2 M631L突变单独或与PA K497R组合，与最小类禽前体病毒相比，在人类细胞系中多个时间点显著增强病毒滴度。在原代人类鼻上皮细胞中，最小类禽前体病毒在感染后72小时在所有3名捐赠者中复制滴度显著低于野生型。在禽类细胞系中，所有突变体显示与野生型病毒相似的生长动力学，表明这些突变对禽类细胞中的病毒适应性/复制影响极小。
牛病毒亚系中较新突变进一步增强B3.13 H5N1聚合酶在哺乳动物而非禽类细胞中的活性
通过持续监测正在进行的奶牛疫情序列，研究人员检测到牛病毒聚合酶基因中进一步已知哺乳动物适应性的出现。将PB2 D740N引入野生型德州奶牛病毒聚合酶，显著提高了牛、人和猪细胞中的聚合酶活性。PB2 Q591R影响较小，在人类细胞中达到统计学显著性。在M631L基础上引入PB2 E627K始终导致最高的聚合酶活性。在牛乳腺外植体、MAC-T和BAT-II细胞中，D740N和E627K均显著增强野生型在多个时间点的复制。在人类肺细胞系和原代分化人鼻上皮细胞中，E627K和D740N也显示增强复制能力。在鸡和鸭细胞中，病毒复制动力学无显著差异。
牛H5N1病毒聚合酶突变使聚合酶适应使用牛ANP32蛋白
PB2残基631位于流感聚合酶与宿主因子ANP32界面附近。在缺乏ANP32A、ANP32B和ANP32E的人类细胞中补充来自其他相关物种的ANP32蛋白，只有鸡ANP32A能强健支持禽类或类禽病毒的聚合酶活性。相反，人和牛ANP32A/B均支持哺乳动物适应性聚合酶。牛ANP32A始终显著比牛ANP32B能更好地支持所有测试组合的聚合酶活性。牛H5N1病毒中的聚合酶突变显著增强了聚合酶与牛和人类ANP32A/B相互作用的能力。与牛ANP32A观察到更强的相互作用，表明PB2 M631L和PA K497R特异性促进有效结合和利用牛ANP32A蛋白。
研究结论与意义
该研究通过在不同相关流感宿主物种的宿主特异性微型基因组和感染实验中使用重构病毒聚合酶，证明PB2 M631L是允许B3.13 H5N1高致病性禽流感病毒在奶牛中有效复制的关键适应性突变。PB2 M631L使聚合酶复合物能够利用牛ANP32蛋白支持其活性，且强烈偏好牛ANP32A而非ANP32B。结构上，在流感聚合酶和宿主ANP32的复合物中，PB2残基631位于氨基酸627和591附近，这些是特征明确的允许禽流感病毒聚合酶适应哺乳动物ANP32蛋白的突变位点。
PB2 M631L在奶牛中固定后，聚合酶中在三个独立支系出现了额外突变。大多数牛序列含有PA K497R，它在缺乏M631L时增加聚合酶活性，并增强病毒在牛乳腺细胞中的复制。定义其他两个早期牛病毒支系的突变组合也显示活性适度增加。
德州奶牛病毒在牛乳腺中复制极为强健，乳汁中报告有高滴度感染性病毒。随着疫情持续，进一步提高牛细胞中聚合酶活性的突变仍在被报告。PB2 D740N出现了三次独立 emergence，PB2 E627K也与M631L一起出现了一次集群，并且截至2025年7月似乎仍在继续扩张。
2025年，美国农业部报告了H5N1从D1.1基因型向奶牛的两次进一步溢出事件。有趣的是，尽管D1.1 PB2与B3.13 PB2有>98.5%的氨基酸同一性，但这两个集群都没有PB2 E627K nor PB2 M631L。这些独立 emergence 提供了进一步证据表明E627K对流感聚合酶在奶牛中没有强选择优势，并且H5N1聚合酶在哺乳动物中存在许多不同的可行适应途径。
当前奶牛病毒对人类构成的风险是明确的：含有哺乳动物适应性如PB2 M631L的奶牛病毒在哺乳动物细胞中比类禽病毒复制更好，因此对消费感染奶的哺乳动物如猫和浣熊构成明显风险。迄今，这些奶牛病毒在雪貂实验中显示低效的空气传播性，尚未适应通过呼吸道途径传播或有效利用人类受体，这对于人际传播至关重要。此外，还存在其他潜在的出现障碍，如抗病毒宿主因子MxA，奶牛病毒对此仍然易感。然而，频繁暴露于一种抗原新颖、高致病性且能在人类细胞中良好复制的流感病毒是令人担忧的。数据显示，出现的奶牛流感病毒也能有效感染禽类和猪细胞，进一步增加了从奶牛向其他物种溢出的风险。事实上，哺乳动物适应性病毒在禽类细胞中似乎没有适应性成本，解释了该病毒高度倾向于溢出到家禽中引起多次疫情，并表明这种病毒如果回溢到野生水禽中可能维持其哺乳动物适应性。
随着每次人类感染和聚合酶活性增加导致更高水平的复制，存在病毒受体特性进一步进化的危险。此外，与人类季节性流感病毒的重配事件可能导致一种新病毒，特别是在北半球冬季流感季节期间。在缺乏有效控制策略的情况下，高致病性H5N1病毒可能现在在美国奶牛中成为地方性流行，即使没有明显疾病也需要持续监测。此外，许多其他H5N1病毒支系和毒株继续通过重配出现，引起人畜共患感染。迫切开发和测试对动物和人类均有效的广谱反应性H5流感疫苗是当务之急。
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