据估计，大约四分之一到三分之一的蛋白质在其功能中需要金属离子[1]。正确组装含有特定金属的金属蛋白是一个挑战，因为蛋白质对金属离子的亲和力主要由金属-蛋白复合物的相对稳定性决定，即Irving-Williams序列（Mg2+ < Mn2+ < Fe2+ < Co2+ < Ni2+ < Cu2+ < Zn2+）。因此，细胞内金属的（生物）可用性控制着蛋白质的正确金属化[1,2]。选择正确的金属还取决于配体的性质和金属结合位点的配位几何结构，但由于蛋白质的灵活性，金属之间的空间选择性并不完美[3]。在进化过程中，一些蛋白质会根据环境中金属的可用性调整其金属利用方式，例如Fe/Mn超氧化物歧化酶[4]。另一方面，即使一种微量元素被另一种取代，错误金属化也是导致金属毒性的主要机制[5]。非必需金属如镉也能与蛋白质形成稳定的复合物，且金属-蛋白复合物的稳定性通常遵循Zn2+ < Pb2+ < Cd2+ < Cu+ < Hg2+的顺序，这意味着这些非必需金属可以轻易取代酶和蛋白质中的微量元素。锌（Zn）和镉（Cd）具有相似的化学性质，但它们对生物体的生物学作用和重要性却截然不同[6]。锌是参与无数生物过程（包括DNA转录和修复）不可或缺的微量元素。据估计，人体中有超过3000种蛋白质是锌依赖性的[7]。相比之下，镉是一种有毒元素，会对细胞代谢产生复杂的多方面影响，例如通过取代酶活性位点上的微量元素（包括锌）来使酶失活[8]。有趣的是，首个非必需金属离子的生理作用实例来自海洋硅藻Thalassiosira weissflogii中的碳酸酐酶，其中催化活性中的Zn2+可以被有毒的Cd2+替代[9,10]。在人体中，镉主要积聚在肾脏、肝脏和肠道中。国际癌症研究机构将镉及其化合物列为人类致癌物[8]。
金属硫蛋白（MTs）是一类低分子量的、富含半胱氨酸（Cys）的蛋白质，存在于生命树的许多（但不是所有）门类中[11]。自1957年首次在马肾皮质中发现MT作为主要镉结合蛋白以来[12]，人们提出了它们在微量营养素稳态、有毒金属解毒和活性氧清除中的作用。1987年，从Triticum aestivum L.（小麦）胚中分离出了第一种植物金属硫蛋白（pMT），最初被命名为EC（因为含有早期标记的半胱氨酸[13]）。植物金属硫蛋白在其一级结构上比大多数其他生物的MTs更加多样化。根据半胱氨酸残基的数量和排列，pMTs被分为四种类型：1型含12个、2型含14个、3型含10个、4型含17个半胱氨酸。1型至3型MTs具有两个富含半胱氨酸的结构域，而4型MTs（如小麦中的EC）则包含三个富含半胱氨酸的结构域。pMTs的表达会在多种刺激下上调，包括重金属、活性氧、各种环境压力和微生物。有人假设不同类型的pMTs具有不同的生理功能，它们并非单一功能。植物MT1–3在多种植物组织和器官以及不同发育阶段都有表达。长期以来，人们认为pMT4仅存在于发育中的种子和花粉中，并且在种子萌发过程中表达会下降。然而，对Arabidopsis thaliana（L.）AtMT4a和AtMT4b以及Hordeum vulgare L.（大麦）HvMT4的分析表明，这些蛋白参与种子发育过程中的锌积累以及种子萌发和幼苗生长期间的转移[14],[15],[16]。此外，有研究表明Brassica napus L.（油菜）BnMT4在早期发育过程中能够区分锌和镉[17]。然而，最新证据表明pMT4在发育的各个阶段都有表达，支持其功能不仅限于种子中的锌稳态[18]。在Xerophyta humilis（Baker）T.Durand & Schinz）这种复苏植物中，脱水时pMT4的表达会上调，而重新水化时则会下调[19]。此外，还有证据表明BnMT4参与种子中的活性氧代谢[20]。除了可能在燕麦幼苗中作为锌选择性过滤器外，Avena sativa L.（燕麦）AsMT4也可能具有抗氧化作用[21]。
小麦中的Ec蛋白（4型pMT）是迄今为止唯一从天然来源分离出的pMT蛋白。该蛋白主要结合六个Zn2+离子，也有部分物种分离出结合五个Zn2+和一个或两个Cu+离子的pMT[13,22]。重组生产的pMT4的金属结合特性分析显示，来自小麦[23]、Helianthus annuus L.（向日葵）[24]、B. napus[17]和A. thaliana[25]的pMT4可以结合最多6个Zn2+或Cd2+离子。金属离子通过两个结构域结合：I结构域（γ结构域）通过6个半胱氨酸残基（Zn2Cys6簇）结合两个二价阳离子[27]，II结构域（βE结构域）通过11个半胱氨酸残基和2个组氨酸（His, H）结合4个Zn2+离子，这些组氨酸在被子植物MT4中是进化保守的（Zn3Cys9簇和单核位点ZnCys2His2）[23,28]。单核位点ZnCys2His2和Zn2Cys6簇是MTs的独特特征，而Zn3Cys9簇则较为常见，例如在哺乳动物MTs中[11,29]。长期以来，人们认为MTs仅通过硫醇基团与金属离子结合。但现在发现，在非脊椎动物中的MTs中，组氨酸的作用比之前认为的更为普遍[30]。例如，在Synechococcus PCC7942蓝细菌的SmtA[31]、Pseudomonas fluorescens Q2–87[32]、Heliscus lugdunensis水生真菌[33]、Caenorhabditis elegans的MTL-1[34]以及4型pMTs[17,22]中，组氨酸在金属结合中都起着重要作用。
世界卫生组织（WHO）估计约有30%的人口可能面临锌缺乏的风险。锌缺乏会导致多种症状，包括生长迟缓、神经系统、免疫系统和消化系统受损以及皮肤问题[35]。应对锌缺乏的一个有前景的方法是生物强化（参见[36]）。虽然植物代谢不需要镉，但它会被多种微量营养素转运蛋白高效吸收，并可能进一步转运到地上部分并在叶片和种子中积累。这是因为大多数参与金属离子吸收、转运和储存的蛋白质的特异性较低[18]。地壳中镉的含量仅比锌低两个数量级左右，且镉通常存在于锌矿中。由于自然过程（如岩石风化或火山喷发），镉也会出现在表土中。然而，农业用地受到镉污染的主要原因是磷酸盐肥料和污泥的使用，以及采矿和煤炭燃烧。此外，随着土壤pH值的降低，植物对镉的吸收会增加，这使得在气候变化和酸雨增加的情况下，镉在食物链中的积累问题更加严重[37]。WHO规定每月每公斤体重镉的最大摄入量为25微克（或每天0.8微克）。除了镉行业工人和吸烟者外，饮食是镉暴露的主要途径[38]。
尽管近年来取得了显著进展，但金属蛋白区分不同金属的机制仍不完全清楚[39]。受之前研究的启发，这些研究强调了4型pMTs区分锌和镉的潜力，我们研究了Sorghum bicolor（L.）Moench MT4（SbMT4）的金属结合能力。为了测试组氨酸残基对金属结合和蛋白质折叠的影响，通过定点突变生成了其中一个或两个组氨酸被酪氨酸取代的突变蛋白。至少有一种pMT4已经观察到组氨酸到酪氨酸的突变[24,40]。此外，还创建了过表达SbMT4野生型和突变型蛋白的转基因Arabidopsis thaliana植物，并分析了整体的锌/镉含量。高粱是第五大重要谷物，是维生素、微量营养素和其他生物活性化合物的良好来源，也是最便宜的热量和微量营养素来源之一。由于其耐热性和耐旱性，高粱在干旱和半干旱地区广泛种植。面对气候变化，高粱成为生物强化的理想候选作物[41]。
