西蒙妮·科斯塔·德·卡斯特罗（Symone Costa de Castro）|布鲁诺·索扎·特谢拉（Bruno Sozza Teixeira）|朱利奥·塞萨尔·杰罗尼莫·巴尔博萨（Júlio César Jeronimo Barbosa）|乌埃德松·达·席尔瓦·达斯·内维斯（Uedson da Silva das Neves）|若昂·吉列尔梅·德·莫拉埃斯·庞特斯（João Guilherme de Moraes Pontes）|柳比卡·塔西奇（Ljubica Tasic）
巴西坎皮纳斯州立大学（UNICAMP）化学研究所生物化学实验室（LQB），邮编13083-970，坎皮纳斯，圣保罗州
摘要 果胶是橙子皮中的主要生物聚合物，其结构复杂且呈分支状，以D-半乳糖醛酸为主要单体。橙子皮还含有黄酮类化合物，这些化合物可以与果胶相互作用并影响其功能特性。我们假设果胶与黄酮类化合物的相互作用方式会因提取条件而异，进而影响它们在果胶和残留生物质中的分布。工业上果胶的提取通常使用无机酸处理，随后通过酒精沉淀法进行分离，提取参数会显著影响果胶的结构和黄酮类化合物的含量。虽然之前的研究主要关注果胶的特性，但尚未系统地评估提取条件对果胶及相应残留生物质中黄酮类化合物组成的影响。在本研究中，我们考察了五种果胶提取条件，利用高分辨率质谱技术鉴定了33种黄酮类化合物，并对果胶和残留生物质进行了分析。这是首次揭示果胶提取条件如何影响黄酮类化合物分布的研究，同时也评估了残留生物质的情况。我们的发现为生产富含黄酮类化合物的果胶提供了新的见解，这些黄酮类化合物在功能性食品和人类健康方面具有潜在应用价值。
引言 柑橘类水果加工过程中产生的残渣（例如橙子）含有多种生物聚合物，包括纤维素、半纤维素和果胶，其中果胶是主要成分。此外，柑橘残渣还富含黄酮类和酚类等次生代谢物，无机成分包括钙（Ca(II)）、镁（Mg(II)等盐类（Guo等人，2023年）。这些成分分布在细胞壁中：果胶和钙主要存在于中间层，而黄酮类化合物则存在于植物细胞内部，也可以分泌到细胞壁中（Chirug等人，2021年）。因此，果胶的提取及后续处理可能会以多种方式破坏这些成分之间的相互作用。 在柑橘类生物聚合物中，果胶是从橙子残渣中提取的主要成分。事实上，橙子皮是果胶提取的主要工业来源，该聚合物在食品工业中广泛用作凝胶剂。此外，果胶还用作乳制品、果汁和冰淇淋中的稳定剂、增稠剂和乳化剂（Freitas等人，2021年）。果胶的主要单糖成分是D-半乳糖醛酸（D-GalA），它通过α -1,4键连接形成线性同聚半乳糖醛酸（HG）结构。果胶中另一种常见的结构是鼠李糖半乳糖醛酸（RG-I），其主链由二糖重复单元[2-α -L-Rha-(1,4)-α -D-GalA-(1)]组成（Liu等人，2025年）。此外，还有17种其他单糖可以掺入果胶结构中（Barrera-Chamorro等人，2025年）。
在柑橘类次生代谢物中，橙皮中含量最高的是 hesperidin。Hesperidin 属于黄酮类化合物中的 flavanone 类。从化学结构上看，黄酮类化合物包含三个环：A 环、B 环和 C 环，其中 A 环和 B 环具有芳香性，C 环含有氧原子。黄酮类化合物根据 C2-C3 双键的存在与否、C3 位置的羟基以及 C4 位置的羰基（C=O）进行分类。它们被分为黄酮（含有 C2-C3 双键和 C-O 基团）、flavanones（不含 C2-C3 双键但含有 C-O 基团）、flavonols（既不含 C2-C3 双键也不含 C4 羰基且含有 C3 羟基）、以及 isoflavones（B 环连接在 C3 位置而非 C2 位置）（Shen 等人，2022年）。
这些黄酮类化合物在橙子皮中以游离形式或苷的形式存在（Cuyckens & Claeys，2004年）。当黄酮醇的游离基团高度甲基化时，称为 polymethoxylated flavonoids（PMF）。黄酮类化合物对人体健康有许多益处，包括抗氧化作用、潜在的抗癌效果以及对心血管疾病、炎症和感染的防护作用（Al-Khayri 等人，2022年；Li 等人，2023年；Shen 等人，2022年；Stanisic 等人，2018年）。在水果中，黄酮类化合物可作为抵御各种植物病原体的防御屏障（Costa 等人，2019年）。
有许多从橙子皮中提取果胶的方法（Akhter 等人，2024年；Singhal & Hulle，2022年）。然而，在工业上，果胶通常使用无机酸（如硝酸、盐酸或硫酸）在高温下提取 ≥30分钟，随后用酒精沉淀（Zoghi 等人，2023年）。
Fakayode 和 Abobi（2018年）通过响应面分析确定了高果胶产率（30%）的最佳条件：pH 1.60、温度 93.07°C 和提取时间 117.0分钟。同样，Kamal 等人（2021年）报告了最佳单因素条件：温度 95°C、pH 1.5 和提取时间 90分钟。提取的果胶的产率和物理化学性质取决于提取工艺。根据 Yu 等人（2021年）的研究，温度会影响产率，而 pH 条件和提取方法会影响物理化学性质。相反，Chen 等人（2021年）指出温度是影响果胶结构的主要因素。
Hesperidin 可以通过多种方法从橙子残渣中提取，包括使用 Soxhlet 装置的溶剂提取（Cypriano 等人，2017年），或通过盐、酸和碱溶液调节 pH 值进行提取（Castro, Barbosa 等人，2024年）。最近的一项专利报道了一种从橙子皮中同时提取 hesperidin 和果胶的方法（湖南新力生物科技有限公司，2014年）。
果胶可以与黄酮类化合物相互作用，其丰富的羧基和甲氧基团可以形成共价（酯键和苷键）和非共价（如氢键和疏水作用）相互作用（Guo 等人，2022年；Liu 等人，2025年）。果胶和黄酮类化合物还可以与铁、钴、镍、锌、钙、镁和铜等金属离子形成复合物（Chirug 等人，2021年；Minzanova 等人，2021年；Torre 等人，1992年）。
尽管关于果胶与多酚（包括黄酮类化合物）相互作用的研究很多（Chirug 等人，2021年；Molet-Rodríguez 等人，2025年），但很少有研究关注提取果胶中的黄酮类化合物的鉴定和定量。Scurria 等人（2021年）报告了柠檬和葡萄柚 IntegroPectin 中含有黄酮类化合物，鉴定了柠檬 IntegroPectin 中的 naringin、hesperidin、eriocitrin、kaempferol 和 kaempferol-7-O-glucuronide，以及葡萄柚 IntegroPectin 中的 naringenin、naringin、hesperidin 和 kaempferol-7-O-glucuronide。值得注意的是，用无机酸提取并用酒精沉淀的商业果胶中不含可检测到的黄酮类化合物。
在我们之前的研究中，我们分析了果胶工业中橙子加工废弃物（OPW）中的黄酮类化合物的含量和类型，发现低果胶含量的 OPW 中糖基化黄酮类化合物的比例较高。我们的研究结果表明，主要是 polymethoxylated flavones 与果胶发生相互作用并被共同提取（Castro 等人，2024年）。Chirug 等人（2018年）报告称，黄酮醇 quercetin 与富铁果胶的相互作用比糖基化黄酮醇 rutin 更强。尽管有这些研究，但关于从橙子残渣中提取的果胶中黄酮类化合物组成的信息仍然很少。
在本研究中，我们分析了在不同条件下使用无机酸提取的果胶样品中的黄酮类化合物分布及其在相应残留物中的含量，模拟了工业上的提取条件。黄酮类化合物通过高分辨率质谱技术进行分析，并通过 GNPS2 数据库进行鉴定。我们的目标是验证之前的发现，并确定用无机酸提取的果胶是否能够吸附和/或结合黄酮类化合物。此外，我们还旨在评估最佳的果胶提取条件，以优化黄酮类化合物的含量，因为大多数关于果胶提取的研究都集中在提高提取产率上，而非生产富含生物活性小分子的果胶。
采样 采样 橙子果实的柑橘皮来自巴西坎皮纳斯州坎皮纳斯市 Unicamp 大学的 Citrus sinensis （L.） Osbeck 品种（2022年11月）。提取果胶之前，将果皮清洗后在 60°C 的空气烤箱中干燥，并用研钵研磨。柑橘残渣和果胶样品的获取：实验设计 果胶的提取使用盐酸（HCl）在 350 rpm 的搅拌条件下进行，方法参考 Sandarini（2017年）的描述。样品以固液比 1:25（m/v）悬浮在酸性溶液中。结果与讨论 用于果胶提取的柑橘皮原料的成分包括总固体、灰分、纤维素、半纤维素、木质素和果胶含量，这些数据已在我们的先前研究中报告（Castro, Stanisic, & Tasic, 2024年）。具体组成如下：总固体 14 ± 1%，灰分 3.8 ± 0.2%；干基条件下：木质素 3.9 ± 0.5%，纤维素 23 ± 1%，半纤维素 8.4 ± 0.8%，果胶 25.5 ± 0.3%。Cypriano 等人（2018年）使用 Floater - CPF 柑橘果肉也得到了类似的结果。结论 本研究表明，果胶提取后残留样品中的黄酮类化合物的数量和种类不仅取决于残留果胶的含量，还取决于提取条件。
利用 FBMN 技术鉴定了 33 种黄酮类化合物。果胶提取后，黄酮苷在残留样品中的浓度仍然很高。值得注意的是，黄酮苷的稳定性受提取条件的影响。
CRediT 作者贡献声明 西蒙妮·科斯塔·德·卡斯特罗（Symone Costa de Castro）： 撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件使用、实验设计、数据分析。布鲁诺·索扎·特谢拉（Bruno Sozza Teixeira）： 撰写 – 审稿与编辑、方法设计、实验设计、数据分析。朱利奥·塞萨尔·杰罗尼莫·巴尔博萨（Júlio César Jeronimo Barbosa）： 撰写 – 审稿与编辑、方法设计、实验设计、数据分析。乌埃德松·达·席尔瓦·达斯·内维斯（Uedson da Silva das Neves）： 撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、数据分析。若昂·吉列尔梅·德·莫拉埃斯·庞特斯（João Guilherme de Moraes Pontes）： 未引用的参考文献 Addi 等人，2022年
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利益冲突声明 作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。致谢 我们非常感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，巴西圣保罗）对这项研究的资助（资助编号 #2014/50867-3 和 #2022/02992-0），特别是感谢提供的奖学金（资助编号 #2023/06874-4 和 #2023/06480-6）。此外，我们也感谢巴西巴西利亚的国家科学技术发展委员会（CNPq，资助编号 #102260/2024-9，J.G.M.P.）。同时，我们也感谢化学研究所的质谱实验室提供的支持。打赏
