高压冷冻条件下，多酚氧化酶在不同物理状态和浓度下的催化活性及构象稳定性

高压冷冻（HPF）对多酚氧化酶（PPO）活性及结构的影响研究，探讨0.1-400 MPa、-20℃下处理对固态晶体（S-PPO）和液态（HL/LL-PPO）PPO的作用机制，发现低浓度液态PPO在HPF中稳定性最佳，低温抑制压力诱导变性，酶活性调控顺序为物理状态＞浓度＞压力＞结晶路径，并验证了BP-ANN模型与分子动力学模拟结合的预测精度。

李景豪|袁珊玉|徐玉娟|景文|邹波|潘健|胡腾根|卢莉|程琳娜

广东省农业科学院蔬菜与农业食品研究所/农业农村部功能性食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广州510640，中国

摘要

本研究探讨了在0.1–400 MPa压力和-20°C温度下，高压冷冻（HPF）处理30分钟对多酚氧化酶（PPO）的影响，包括其固态晶体（S-PPO）和液态形式（HL/LL-PPO）在高浓度和低浓度下的变化。根据酶活性和结构变化，影响程度排序如下：物理状态 > 浓度 > 压力 > 结晶路径。值得注意的是，在HPF条件下，LL-PPO比HL-PPO和S-PPO具有更高的稳定性，低温对S-PPO的压力诱导变性具有保护作用。此外，巯基含量和高浓度状态对于维持L-PPO的结构稳定性至关重要。通过改变PPO的物理状态（液态和固态），可以有效地调节其活性。此外，反向传播人工神经网络模型能够精确描述空间结构与酶活性之间的相关性。

引言

多酚氧化酶（PPO，EC.1.14.18.1）是一种III型铜蛋白氧化酶，可催化新鲜水果和蔬菜中的酚类物质发生褐变，严重影响其商业价值。高压冷冻（HPF）是一种利用物理场辅助的冷冻技术，通过压力改变水的冰点转变和过冷度。这一过程会导致多种冰晶形成途径，包括压力辅助冷冻（PAF）和压力转移冷冻（PSF）。目前，相关研究从不同角度探讨了PPO的调控机制。Cheng等人（2021年）研究了高压冷冻（HPF）、高压处理（HPP）以及HPP-浸渍冷冻（HPP-IF）对PPO热力学性质和构象变化的影响，阐明了压力和冷冻因素在PPO变性过程中的相互作用机制。同时，关于过氧化物酶（POD）的研究也发现了类似的现象：Liang等人（2024年）研究了HPF在不同初始状态下对POD活性的影响，进一步揭示了多种因素调节酶结构和活性的综合调控机制。分子动力学模拟（MD）技术能够动态预测冷冻过程中酶的动力学和聚集趋势，解决了传统物理和化学实验方法无法可视化酶系统分子间相互作用的局限性。Lee（2018年）使用TIP4P/冰水模型模拟了抗冻蛋白，获得了最接近实际熔点的结果；Duran、Minatovicz、Bai、Shin、Mohammadiarani和Chaudhuri（2021年）在磷酸盐缓冲液中研究了乳酸脱氢酶蛋白在结冰存在/不存在情况下的分子动力学模拟，发现较快的冷冻速率会导致分子内氢键数量增加、弹性蛋白残基减少、溶剂可接触表面积减小，从而提高结构稳定性。反向传播人工神经网络（BP-ANN）是一种模拟人脑神经网络结构和功能的计算模型，可用于食品分析中准确分析和处理实验数据中的非线性趋势（Bhagya & Dash, 2020）。更多研究将BP-ANN应用于食品加工领域，例如Huang等人（2023年）使用BP-ANN模型成功预测了γ射线辐照熏制培根的质量特性。然而，目前尚无研究探讨BP-ANN在HPF条件下预测PPO相关特性的应用。因此，本研究旨在将分子模拟与人工智能模型相结合。一方面，利用动态可视化的分子模型揭示PPO在水果和蔬菜褐变过程中的分子水平变化；另一方面，BP-ANN模型为HPF技术在水果和蔬菜智能非热加工中的应用提供理论和技术支持。

样本制备

样品制备

蘑菇来源的多酚氧化酶（500 U/mg）购自Aladdin Chemical Co.（中国上海），无需纯化即可使用。本研究中使用的其他化学试剂均为分析级。

液态多酚氧化酶（L-PPO）：将酪氨酸酶溶解在磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.4）中，配制成0.2 mg/mL（低浓度，LL-PPO）和1 mg/mL（高浓度，HL-PPO）的溶液。溶液经真空密封后储存于4°C。

固态晶体多酚氧化酶：将0.2 mg的PPO放入聚乙烯袋中

活性变化和巯基团

图1(a)显示的酶活性分析和图1(b)中的巯基含量分析表明，HPF处理对PPO的影响显著受其初始物理状态的影响，各种因素的调控效应呈现出明显的层次结构。具体结果如下：（1）两种指标在LL-PPO中变化最为显著，酶活性下降至48.12%–67.63%，巯基含量下降至

结论

本研究阐明了HPF对不同初始状态（固态/液态，低浓度/高浓度）下PPO活性的调控机制和关键影响因素。结论如下：（1）L-PPO在HPF处理后活性显著下降，主要机制涉及二级结构的重排（α-螺旋丢失和随机卷曲的增加）以及三级结构的改变（例如疏水基团的暴露和淬火）

作者贡献声明

李景豪：撰写初稿、验证、软件应用、方法设计、实验研究、数据分析。袁珊玉：撰写、审稿与编辑、软件应用、方法设计。徐玉娟：撰写、审稿与编辑、概念构思。景文：撰写、审稿与编辑。邹波：方法设计。潘健：数据管理。胡腾根：软件应用。卢莉：撰写、审稿与编辑、资金筹集。程琳娜：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金管理

未引用参考文献

Kiranmani, Sameena和Gangagni, 2025

Ma等人，2025

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32402300）、广州市科技计划（项目编号：2023B01J2004、2025A04J4300）、广东省现代农业产业共性关键技术创新研究团队建设项目（加工与保存共性关键技术）（项目编号：2024CXTD16）、广东省农业科学院优秀人才引进计划（项目编号：R2020YJ-YB2001）以及现代种子产业创新的支持。