摘要
蛋白水解加工是一种重要的翻译后修饰。液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）工作流程在降解组学分析中功能强大，但本质上牺牲了空间信息。基质辅助激光解吸电离（MALDI）具有快速空间分析的潜力，但胰蛋白酶肽的MALDI成像仍面临谱图拥挤和MALDI MS/MS鉴定能力受限的挑战。
为解决这些局限性，本研究开发了芘共轭的2-吡啶甲醛（pyr-2PCA）标记物，用于选择性N端标记并增强检测灵敏度。2PCA试剂专一性地修饰N端α-胺，而非赖氨酸ε-胺，这一点可通过MALDI-MS证实。通过稀释可最小化浓度依赖性副反应。在prm-PASEF（MALDI MS/MS）中，2PCA标记的肽产生一个独特的报告离子，可作为成功标记的标志。
将2PCA与芘结构共价连接得到的pyr-2PCA标记物，使得肽的无基质、标记辅助激光解吸电离质谱（LALDI-MS）测量成为可能。研究表明，在胰蛋白酶消化前使用芘偶联的2PCA标记物（pyr-2PCA）进行标记，可在LALDI中选择性检测N端肽，且无明显脱靶标记。
本研究首次展示并表征了这种新型pyr-2PCA标记物，从而为基于MALDI/LALDI的原位空间N端组学研究蛋白水解过程奠定了基础并展示了其未来潜力。
1 引言
蛋白质N端携带有关蛋白质功能状态的重要信息。蛋白水解加工是一种准不可逆的翻译后修饰，影响蛋白质的定位、稳定性、活性和折叠。它产生截短的蛋白质作为切割产物，这些产物拥有新N端（neo-N-termini）。失调的蛋白水解切割可能导致病理状况，并在疾病相关过程中发挥重要作用，包括异常的细胞外基质（ECM）重塑和肿瘤微环境（TME）的改变。蛋白酶抑制剂在临床上的成功，特别是在抗病毒治疗中，强调了靶向蛋白水解途径的治疗潜力以及理解生物系统中蛋白水解过程的重要性。
使用基于液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）的工作流程能够深入表征蛋白水解切割事件。大多数N端组学方法采用N端标记和富集步骤，从而区分天然或新N端与胰蛋白酶产生的N端。然而，大多数标记试剂基于N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯修饰，主要无法仅修饰α-胺而保持赖氨酸侧链上的ε-胺不变。一个例外是通过NHS基团引入的三（三甲氧基苯基）磷鎓（TMPP-Ac-OSu），它可以实现选择性α-胺标记用于LC–MS/MS N端组学，但需要严格的pH控制（pH 8.2）以实现选择性。TMPP-Ac-OSu也曾用于标记肽进行MALDI MS/MS分析，证明了固定电荷标记可增强序列信息性碎片。
MacDonald等人引入了试剂2-吡啶甲醛（2PCA），它通过分子内环化反应专一性地与N端α-胺反应，形成稳定的咪唑烷酮环，该环不能与赖氨酸侧链胺形成。因此，如果在胰蛋白酶消化前进行标记，2PCA反应可以专一性地修饰天然或新N端的肽。
由于所有蛋白质水平标记方法都依赖于批量蛋白质提取和LC–MS/MS测量，大多数空间信息和组织背景在样品制备过程中丢失。基于基质辅助激光解吸电离（MALDI）的方法能够通过MS/MS快速原位探测肽和蛋白质，因此是一种不依赖于抗体的方式。对于空间蛋白质组学，典型的MALDI成像工作流程采用胰蛋白酶消化。然而，胰蛋白酶肽的MALDI成像仍然受到两个主要问题的限制：第一，缺乏对每个检测到的信号的自动MS/MS鉴定；第二，缺少色谱分离，因此每个激光点处的样品复杂性很高。最近，几种利用捕获离子淌度（trapped ion mobility）的工具，如iprm-PASEF或SIMSEF，为将简单、自动化和标准化的MS/MS分析物验证整合到MALDI成像中铺平了道路。这里，捕获离子淌度谱（TIMS）被用作一个额外的维度来积累和分离离子，从而实现多重碎片化和更高效的离子利用。然而，缺少色谱分离和无法在MALDI中特异性靶向低丰度信号仍然是需要克服的障碍。这一限制对于基于MALDI成像的N端组学尤其相关，因为N端肽通常只是每个蛋白质产生的众多胰蛋白酶肽中的一个，因此代表性严重不足。
标记辅助激光解吸电离质谱（LA-LDI-或LALDI-MS）是一种无基质技术，其中分析物通过共价键或螯合与多芳香族标记物偶联。标记物的附着导致分析物解吸和电离，而无需与外部基质共结晶。据推测，激光能量通过其固有的π电子系统被吸收，电离通过电子转移过程发生。芘衍生结构已被证明在LALDI-MS中特别有效，能够在复杂混合物中实现标记分子的有效电离和选择性检测。迄今为止，LALDI-MS已用于评估化学反应机制以及金属离子、1,2-二醇和伯胺的检测分析。重要的是，Yoneda等人使用酰胺芘NHS酯衍生物在胰蛋白酶消化前标记蛋白质的赖氨酸侧链ε-胺，并证明了标记肽在LALDI-MS中的可检测性增加，展示了共价标记的芘结构增强肽信号强度的潜力。
本文介绍了芘偶联的2PCA标记物，旨在通过α-胺的环化反应选择性标记蛋白质N端和新N端。通过将芘结构整合到2PCA标记物中，我们开启了在LALDI方式下特异性标记和检测N端肽的前景。我们首次对含芘的2PCA标记物及其在LALDI/MALDI-MS中用于N端肽标记的应用进行了表征，从而为基于LALDI/MALDI的原位空间N端组学研究蛋白水解过程奠定了基础并展示了未来潜力。
2 材料与方法
2.1 化合物合成
试剂购自Sigma-Aldrich、BLD pharm和TCI Chemicals，未经进一步纯化直接使用。所有溶剂，包括无水溶剂，均按商业来源获得直接使用。对空气和水敏感的试剂和反应通常在氩气气氛下处理。反应进程通过Merck硅胶板60 F254上的薄层色谱（TLC）监测。检测使用HP-UVIS（biostep）紫外柜在254 nm波长下进行，或使用高锰酸钾染色。快速色谱纯化在Biotage Isolera One纯化系统上进行，分别使用Biotage Sfär Silica D和Biotage SFär C18 D快速柱。核磁共振（NMR）谱在Bruker Avance（400 MHz）NMR谱仪上于298 K记录。化学位移（δ）以百万分之一（ppm）为单位给出，耦合常数（J）以赫兹（Hz）为单位，并使用标准缩写报告多重性。
pip2PCA按照文献程序合成。将市售的1-芘丁酸（58 mg, 0.20 mmol）、6-（哌嗪-1-基甲基）吡啶-2-甲醛盐酸盐（pip2PCA）（48 mg, 0.20 mmol）、1-[双（二甲氨基）亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸盐（HATU, 91 mg, 0.24 mmol）和三乙胺（0.14 mL, 0.60 mmol）在无水DMF（1.0 mL）中的混合物在室温下反应过夜。反应完成后，减少溶剂，粗产物在Biotage SFär C18 D-12 g柱上使用水/甲醇梯度纯化，得到49 mg（0.10 mmol, 52%）分析纯的化合物6-（（4-（4-（芘-1-基）丁酰基）哌嗪-1-基）甲基）吡啶-2-甲醛（pyr-2PCA）。Dma-pyr-GG从市售的4-（芘-1-基）丁酸经几步合成。所有使用的化合物总结在支持信息中。
2.2 组织和肽样品
小鼠肾脏组织是从因不相关实验目的而处死的动物中获得的剩余组织。小鼠肾脏样品代表原本会被丢弃的剩余材料。小鼠肾脏样品根据标准方案进行福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）。将FFPE块切成2 μm厚的切片并安装在IntelliSlides上。合成肽从不同来源获得。
2.3 溶液中Pip2PCA标记
溶液中标记在15 μL反应体积中进行，包含300 μM肽，15 mM pip2PCA（DMSO储备液），摩尔比pip2PCA试剂与肽为50:1，28.5% DMSO，并通过添加25 mM磷酸盐缓冲液调节pH至8。标记在37°C下进行24小时。标记反应后，将反应混合物用1%甲酸（FA）水溶液稀释1:100（V/V），并在37°C孵育5分钟。然后，将1 μL样品直接点在氧化铟锡（ITO）载玻片上，与10 mg/mL CHCA基质（50% ACN, 1% TFA）以1:1（V/V）混合，并在50°C烘箱中干燥，用于后续质谱分析。
2.4 溶液中Pyr-2PCA标记
对于pyr-2PCA，300 μM肽在30 μL反应体积中用3 mM pyr-2PCA（10:1 M比率）标记。DMSO量为7.1%，并加入50% ACN以增加溶解度。使用磷酸盐缓冲液将pH调节至8，终浓度为6.7 mM。标记反应在37°C下进行24小时。之后，样品用1% TFA水溶液补至200 μL，在37°C孵育5分钟，并使用HyperSep SpinTip C-18柱进行固相萃取（SPE）纯化。
2.5 溶液中胰蛋白酶消化
对于胰蛋白酶消化，如2.4所述制备30 μL反应混合物（或如2.3所述15 μL），并用1% TFA稀释至终体积200 μL，然后上样到Hypersep SpinTip C-18柱上。用8% ACN和0.05% TFA洗涤三次后，使用68% ACN和0.05% TFA洗脱肽。样品真空干燥并重悬于50 μL 100 mM HEPES中。之后，加入0.5 μg Trypsin Gold，并在50°C摇荡孵育2小时。之后，再次使用Hypersep进行SPE清理。洗脱混合物（50 μL）直接点在ITO载玻片上，与CHCA基质以1:1（V/V）混合，并在50°C烘箱中干燥5分钟，用于后续质谱分析。
2.6 Dma-Pyr-GG滴定
滴定使用恒定量的未标记合成肽进行。将dma-pyr-GG以五种不同量与之混合。每种条件在同一个ITO载玻片上制备一个点，并在一次成像运行中成像。LALDI测量后，进行MALDI测量。
2.7 使用MALDI-MS、MALDI-MS/MS和MALDI prm-PASEF进行Pip2PCA标记分析
所有测量在TimsTOF FleX上以正离子反射器模式进行。MALDI MS1点测量在TIMS关闭的情况下进行。所有MALDI MS/MS测量均在prm-PASEF模式下进行。prm-PASEF测量在DataAnalysis中进行分析和绘图。MS2谱图导出为.mgf文件，并使用Python中的pyteomics包可视化指定的理论b离子和y离子。
2.8 Pyr-2PCA在MALDI/LALDI成像模式下的分析
所有pyr-2PCA的测量均在成像模式下进行，以考虑激光点和点内变异性。此外，LALDI和MALDI测量在同一位置进行。所有成像数据集在SCiLS Lab中进行分析和可视化。选择均方根（RMS）归一化和10 ppm的m/z间隔宽度用于所有分析。
2.9 载玻片上Pip2PCA组织标记
对于iprm-PASEF模式下的MALDI成像报告离子检测，首先对一张FFPE小鼠肾脏载玻片进行脱蜡、抗原修复等预处理。然后，应用标记试剂（10 mM pip2PCA和165 mM pH 8磷酸盐缓冲液），并在加湿室中于37°C孵育24小时。之后，清洗载玻片，喷洒胰蛋白酶并在加湿室中于50°C孵育2小时。最后，应用CHCA基质。
2.10 光学显微镜
使用LEICA EC3显微镜和4×/0.10物镜获取光学显微镜图像。
2.11 大型语言模型、人工智能和机器学习工具的使用
使用“OpenAI”和“DeepL Write”来改进语言，支持文献搜索和写作风格。
3 结果
3.1 Pip2PCA标记肽在MALDI-MS中的可检测性
2PCA与伯α-胺的化学反应已在先前使用LC-ESI-MS/MS和NMR光谱的研究中得到广泛表征，证明了其效率和相对于赖氨酸ε-胺侧链的选择性。相比之下，MALDI-MS通常产生单电荷离子，并且易于形成簇。因此，本研究的初步目标是评估基于2PCA的N端标记用于MALDI-MS分析的可行性、可检测性和可转移性。
为了清晰评估MALDI-MS中的2PCA标记，我们选择了低复杂性的合成肽作为实验设置。为了允许后续与官能团（如芘结构）偶联，所有实验均使用哌嗪偶联的2PCA衍生物（pip2PCA）。按照既定方案，反应在37°C、pH 8、肽与pip2PCA摩尔比为1:50的条件下进行24小时。在这些条件下，通过MALDI-MS测定，合成肽AVRPGYPK（SP1）的标记效率超过80%。通过两个合成肽的MALDI MS/MS分析证实了N末端的正确标记。SP1的MS/MS谱图显示了未移动的y离子系列，而例如b1至b3离子系列显示了m/z 187.11的质量位移，与pip2PCA修饰一致。我们注意到，与未标记的肽相比，pip2PCA标记影响了碎片模式。此外，我们观察到一种双标记副反应，该反应在水性条件下不稳定。然而，在水性稀释后，对应于pip2PCA双标记副产物的峰（例如，SP1的m/z 1261.73和m/z 1279.74）的相对强度保持在3%以下。
对于在N末端位置包含甘氨酸的合成肽GSAGPPGATGFPGAAGR（SP2），观察到几个意外信号和较低的标记效率，这与先前的报告一致。m/z 1630.8063和1835.9261处的两个特定峰表明存在两步反应机制，包括初始缩合和随后的二次pip2PCA加成而无水损失。尽管确切结构尚未解析，但我们指出，Tayri-Wilk等人在甲醛交联中观察到了类似的、涉及醛的双加成反应。
通过LC–MS/MS检测pip2PCA标记的肽默认包括基于酸性条件下反相色谱的色谱分离步骤。在潜在的MALDI应用中，这一步骤是缺失的。因此，我们直接将标记反应混合物（未经色谱或固相萃取（SPE）清理）点在ITO载玻片上，随后应用MALDI基质并进行MALDI-MS测量。对于两种测试的肽SP1和SP2，这种方法产生了几个意外的m/z值，表明存在多个pip2PCA标记的产物，而不是单一的N末端标记分子。
为了更好地理解pip2PCA在这种情况下对ɑ-和ε-胺的反应性，合成了含有C末端赖氨酸的合成肽SP1，其具有（i）仅N末端乙酰化，（ii）仅赖氨酸侧链乙酰化，或（iii）两个伯胺均乙酰化。将这些肽物种进行上述“直接点样”方法。对于具有游离α-或ε-胺的肽物种，我们观察到意外的质量位移，分别为m/z 199.11（相对于预期的pip2PCA缩合产物+12.00 Da）和m/z 374.22（与双pip2PCA缩合一致）。在用1% FA水溶液进行1:100稀释后，只有具有游离α-胺的肽显示出质量位移，即预期的m/z 187.11位移。该结果证实了pip2PCA对N末端的选择性和正确标记，及其在MALDI-MS中的可检测性。同时强调了酸性水溶液孵育步骤对于水解中间加合物的必要性，这一步不一定包含在MALDI-MS中（与LC-ESI-MS/MS相反）。
因此，我们得出结论，观察到的非典型质量位移是由涉及单个伯胺的反应引起的，双标记发生在同一个胺部分上，而不是多个不同的位点。我们假设，升高的pip2PCA浓度促进了副反应，可能涉及pip2PCA偶联的哌嗪接头作为反应位点。m/z 199.11质量位移的结构身份尚不明确。然而，这些副反应似乎是浓度依赖性和可逆的，并且可以在稀释的水性条件下最小化。
3.2 Pip2PCA在蛋白质水平标记用于MALDI-MS
3.2.1 用于MALDI-MS的溶液中标记
我们的最终目标是选择性靶向新N末端用于MALDI-MS，同时避免标记（以及可能检测）在标记后胰蛋白酶消化产生的内部胰蛋白酶肽。因此，在标记反应后有效去除未反应的过量pip2PCA化合物至关重要。MacDonald等人证明了蛋白质的Pip2PCA标记可用于LC-ESI-MS/MS。然而，先前提出的关于MALDI-MS检测到的酸不稳定副产物的数据促使我们评估使用MALDI-MS检测肽的工作流程。
我们使用具有三个胰蛋白酶切割位点的β-淀粉样 polypeptide DAEFR HDSGYEVHHQK LVFFAEDVGSNK GAIIGLMVGGVVIA进行评估。胰蛋白酶消化后的未修饰多肽的MALDI-MS显示序列DAEFR（m/z 637.2940；N末端）、HDSGYEVHHQK（m/z 1336.6029）和LVFFAEDVGSNK（m/z 1325.6735）的强信号。C末端肽GAIIGLMVGGVVIA（m/z 1269.7598）未被检测到，可能是由于缺乏赖氨酸或精氨酸残基。在pip2PCA标记后，将反应混合物稀释并使用C18 SPE进行清理，包括用0.05% TFA和8% ACN洗涤。之后，将pip2PCA标记的多肽在50°C下胰蛋白酶消化2小时，并使用MALDI-MS进行分析。两个内部胰蛋白酶肽HDSGYEVHHQK（m/z 1336.6029）和LVFFAEDVGSNK（m/z 1325.6735）的信号未受影响。天然N末端肽DAEFR（m/z 637.2940）的信号消失，并且可以检测到pip2PCA-DAEFR（m/z 824.4049）的新信号。因此，我们成功地用MALDI-MS检测再现了多肽N末端的pip2PCA标记。
3.2.2 在prm-PASEF（MALDI MS/MS）模式下的报告离子检测
最近，prm-PASEF被引入作为TimsTOF Flex的一种新型多重MS/MS采集模式。这里，四极杆前的双捕获离子淌度质谱（TIMS）池设置允许通过其逆减少离子淌度（1/K 0 ）积累和分离多个前体离子。从而优化了离子利用，改善了MALDI成像中串联质谱数据的生成，并促进了肽的原位鉴定。对于pip2PCA标记的肽，使用prm-PASEF的MALDI MS2在其MS/MS碎片轨迹中突出显示了一个m/z 205.1476的报告离子。检测到的m/z 205.1476碎片符合预期m/z 205.1448的碎片离子，该离子源自咪唑烷酮环结构，特别是如图所示的亚胺离子，质量偏差约为13.6 ppm。与这一分配一致，在使用下述修饰的pip2PCA标记物的iprm-PASEF模式中观察到了相应的m/z 475.25碎片。
当分析pip2PCA标记和未标记肽的混合物时，MS2报告离子检测足以确定pip2PCA标记状态，无论假定的MS1质量位移如何。我们提出，在prm-PASEF或MS/MS测量中存在此报告离子作为pip2PCA标记的标志是有价值的。我们成功地在pip2PCA标记组织的MALDI成像测量中演示了所述报告离子的原位检测。这里，如2.9节所述制备FFPE小鼠肾脏组织。对于iprm-PASEF采集，采用了两个宽的、探索性的隔离窗口，信号分辨率集中在较低的m/z范围。使用这些宽窗口使得能够对异质性肽群体进行碎片化，为在选定的m/z范围内部分成功的pip2PCA标记提供了证据。这里，我们报告检测到一个m/z 205.1424的信号，与预期的报告离子质量匹配，误差为11.7 ppm。该信号在pip2PCA标记的样品中以低强度检测到，而在对照中仅在噪声水平发现。我们假设该信号源自pip2PCA标签，尽管其确切身份尚待完全验证。关于所提出报告离子的推定序列特异性及其在LC-ESI-MS/MS中的可检测性的全蛋白质组研究超出了本概念验证研究的范围。
3.3 通过整合芘衍生结构实现LALDI中的2PCA标记
3.3.1 芘共轭2PCA标记物实现肽的LALDI测量
标记辅助激光解吸电离（LALDI）-MS是MALDI-MS的一种无基质变体，其中基质样分子通过共价键或螯合与感兴趣的分析物偶联。例如，用基质样芘标记物衍生化碳水化合物使得它们能够在不需要与常规基质额外共结晶的情况下进行LALDI检测。我们旨在评估蛋白质N末端的2PCA标记是否可以与它们的（共价）衍生化与基质样芘标记物相结合。我们提出，这种方法将促进N末端肽在LALDI-MS中的选择性电离和检测，而无需大多数基于LC-ESI-MS/MS的N端组学策略所需的生化富集步骤。我们进一步假设，基于LALDI的N端组学将降低包含数百至数千种蛋白质形式的样品的复杂性。由于质谱成像（MSI）缺乏色谱分离，这种样品复杂性的降低对于建立基于质谱成像（MSI）的N端组学方法可能至关重要。
为了评估这些机会，我们通过将pip2PCA接头与掺入芘的LALDI标记物（pyr-2PCA标签）共轭，开发了一种新型标记结构，从而实现与N末端的选择性偶联。新的pyr-2PCA标签通过市售的1-芘丁酸与含哌嗪的2PCA衍生物之间的酰胺偶联合成。2-PCA中间体从2,6-吡啶二甲醇开始，按照先前报道的文献程序分五步制备。最终的酰胺键形成在标准偶联条件下顺利进行，得到所需的pyr-2PCA标签。完整的合成路线和pyr-2PCA化合物的NMR分析可在支持信息中找到。
为了概念验证，我们用pyr-2PCA标签或不含芘的pip2PCA标签标记了序列为MRFA（SP3）的合成肽。pyr-2PCA序列被LALDI检测到，而仅用pip2PCA标记的肽在LALDI模式下仍无法检测到。为了考虑点质量和激光点性能的变异性，在LALDI模式下对六个重复点进行了成像。用CHCA基质过度点样相同的点使得能够进行后续的MALDI对照测量，这证实了pyr-2PCA标记肽的LALDI基质量，并对照了pip2PCA标记肽的存在。我们观察到LALDI和MALDI点内不同的结晶行为和不同的信号分布。虽然CHCA混合样品形成典型的晶体结构，但pyr-2PCA标记的点表现出薄膜状形态，这与报道的LALDI在最小化基质晶体尺寸和改善均质性方面的优势一致。
3.3.2 Pyr-2PCA标签继承协同和自电离效应
在溶液相标记后，观察到pyr-2PCA结构存在明显的协同电离效应，即使在没有CHCA基质共结晶的情况下，未标记的加标肽仍可被LALDI-MS检测到。比较LALDI-MS和MALDI-MS，在LALDI中观察到加标肽的信号强度较低，尽管随后在CHCA过度点样后测量了相同的点。此外，我们观察到m/z 476.2320处有一个强信号，对应于完全完整的pyr-2PCA化合物，表明pyr-2PCA在基于C18的SPE清理过程中未被完全去除，并在反应孵育和后续处理步骤中保持稳定。这些观察结果表明，LALDI标签的芘部分具有基质样特性，能够促进共存未标记分析物的解吸和电离，尽管效率低于标准基质如CHCA。此外，我们证明，即使在LALDI模式下，iprm-PASEF测量也具有通过报告离子检测区分标记和未标记样本的能力。
未反应的pyr-2PCA标记试剂（m/z 476.232）的存在突出了在MSI潜在应用中去除它的必要性。在水性或有机溶剂中的洗涤步骤通常用于保存形态结构的组织学染色中。
然而，协同电离也可能由蛋白质反应并偶联的pyr-2PCA促进。为了评估这种可能性，我们合成了一种确定的二肽模拟物dma-pyr-GG，其中二甲氨基-芘基团与Gly-Gly支架偶联，产生单一分子物种。在LALDI MS1分析后，我们观察到质量增加+17.02 Da，我们将其归因于二甲氨基（–N(CH3 )2 ）部分的自发羟基化。当 在 L A L D
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