摘要
受精前暴露于低温会增加杂色海胆（Lytechinus variegatus）卵子发生多精受精的可能性。电生理记录显示，冷休克部分破坏了卵子的动作电位，在受精反应期间产生一个低于阈值的去极化。这种衰减的膜电位变化似乎不足以激活多精受精的快速阻断，从而允许多个精子进入。这些发现揭示了海胆卵多精受精电屏障中存在一个温度敏感性的脆弱环节。
引言
海胆卵的受精启动了一系列支持合子发育的电学、生化和结构变化。最早的事件之一是精子和卵子之间电连续性的建立，这会增加膜电导并触发卵子静息膜电位（Vrm）的去极化。这种去极化反应被称为受精电位，已在多个物种中得到记录。
海胆卵采用两种机制来防止多精受精。快速阻断涉及由受精电位触发的Vm快速、瞬时去极化。类似的电学阻断已在海星、螠虫、两栖类、纽虫和七鳃鳗等动物中有所描述。第二种机制是受精膜，它在受精电位开始后15-20秒通过皮质颗粒胞吐作用形成。破坏任一屏障都可能导致多精受精和异常发育。
在某些条件下，例如精子浓度升高或环境压力，这些保护机制可能会被破坏。冷休克已被证明可诱导地中海海胆（Paracentrotus lividus）卵发生多精受精，可能通过改变肌动蛋白或其他细胞骨架成分实现。在冷暴露的牛卵母细胞和鱼卵中也报道了类似效应。低温已知会改变多种细胞类型的膜流动性和离子通道行为，包括神经元，这提示类似的生物物理变化可能导致海洋配子受精失败。
本研究重新审视了海胆卵中冷诱导多精受精的机制。电生理数据表明，冷休克损害了多精受精的快速阻断，允许多个精子进入。这些发现为杂色海胆（Lytechinus variegatus）受精的电屏障存在温度敏感性破坏提供了证据。
背景
当卵子膜电位自发维持在–70至–80毫伏时，杂色海胆卵对精子的电生理反应如下：精卵之间电连续性的建立导致受精电位的产生。在初始兴奋相（P1）期间，精子接触位点附近的局部电导增加使Vm从约–75毫伏去极化至约–60毫伏的阈值。这种去极化激活电压门控钙通道，触发动作电位，将Vm驱动至约+20至+30毫伏。这种约100毫伏的快速转变构成了多精受精的快速阻断，有效防止多精受精。随后是持续约十秒的10-20毫伏复极化，标志着P1的结束。
在激活相（P2）中，发生第二次去极化，在受精后约30-40秒达到约+25毫伏的峰值。在此阶段，受精膜开始从精子进入位点向对极抬起。这层膜以及P2的持续去极化加强了对多余精子的阻断。
除了直接记录Vm，多精受精的电屏障也通过使用电压钳制（Vc）的卵子进行研究，将其维持在特定电位。精子附着在很宽的Vm范围（+17至–100毫伏）内都会引发电生理反应，表明存在电连续性。然而，当卵子被钳制在0至+15毫伏之间时， consistently 观察到精子进入，且通常先有多个表面附着。在比+17毫伏更正的Vm值时，精子可能粘附在卵子表面，但膜融合和进入被阻断。这些发现突显了膜电位阈值在调节精子进入中的关键作用，并表明即使是轻微的去极化缺陷——例如由冷休克诱导的——也可能损害多精受精的快速阻断。
结果
冷处理增加多精受精率
在杂色海胆卵的正常受精条件下，多精受精通常很少见。然而，受精前冷暴露显著增加了多个精子进入的发生率。冷处理卵表现出多精受精的显著增加（对照：9.6% ± 3.0%，处理：66.4% ± 9.1%），并伴有卵裂异常的平行增加（对照：11.4% ± 0.70%，处理：60.5% ± 9.6%）。代表性显微照片显示了冷处理卵中浓缩的超数精子核和异常的卵裂模式。
冷休克对受精膜抬起的影响
为了测试冷暴露是否改变受精膜抬起的时间，对对照和处理卵进行受精并监测。两组都抬起了完整的受精膜，且抬起时间无显著差异。对照卵在受精后43.9 ± 0.80秒抬起，而处理卵在45.7 ± 1.3秒抬起。
冷诱导的异常卵裂是可逆的
冷休克后分阶段受精显示正常卵裂逐渐恢复。处理后60分钟，处理组和对照组的卵裂结果相当，无显著差异。这些发现表明冷诱导的卵裂缺陷是短暂且可逆的。
冷休克对海胆卵电生理特性的影响
电生理记录揭示了对照和冷休克卵在动作电位动力学上的显著差异。在未处理卵中，去极化电流脉冲（30 pA, 1.0秒）引发了一个强劲的钙动作电位，峰值接近+20毫伏，持续约10秒后自发复极化至–78毫伏。相比之下，冷处理卵需要更强的刺激（48和72 pA, 1和3.5秒）才能引发较弱的反应，峰值接近0至+10毫伏，持续时间与施加的脉冲紧密耦合。这些反应不是自我维持的，并在脉冲终止后立即返回基线。定量分析证实冷处理卵的动作电位幅度显著降低。
典型的受精电位记录显示其由两个不同的相位组成：初始兴奋相（P1）和随后的激活相（P2）。在P1期间，Vm在1-2秒内从静息值–81毫伏转变约100毫伏至约+20毫伏。随后是约10秒内逐渐的约10毫伏负向转变，标志着P1的结束。P2的特征是第二次去极化至约+25毫伏，持续约30秒，随后缓慢复极化朝向原始静息Vm。
来自未处理对照卵的受精电位记录显示，在整个P1和P2期间Vm均远高于0毫伏，与完整的多精受精快速阻断一致。相比之下，来自两个冷休克卵的受精电位显示出衰减的P1反应，Vm在约0毫伏附近平台期持续约8-10秒，表明快速阻断部分失活。在这两种情况下，都有两个精子进入卵子，通过双受精锥和星体证明。这些多精受精合子随后表现出异常卵裂。P1 Vm值的时间分析显示，对照卵的抑制电位显著更正。
讨论
杂色海胆卵在受精前暴露于低温会显著增加多精受精的发生率。由于受精膜抬起在对照组和处理组中发生在可比的时间，冷休克的多精受精诱导效应可能先于皮质颗粒胞吐作用。这促使研究冷暴露是否损害了电介导的多精受精阻断。
电生理记录显示，悬浮在正常海水中的冷处理卵在受精电位的P1期间表现出衰减的去极化。具体而言，冷休克似乎部分损害了卵子的动作电位机制，导致去极化幅度不足，不足以阻止多余精子的融合和进入。记录揭示了一个约8-10秒的窗口期，期间Vm在0毫伏附近形成平台期，在延迟的抑制性转变之前为多个精子进入创造了许可状态。这些发现与电压钳研究一致，表明0 ± 10毫伏附近的电位对精子进入高度许可，几乎所有在此范围内触发电生理反应的精子都能成功穿透卵子。
在暴露于1毫摩尔尼古丁的紫球海胆卵中也报道了类似的受精电位衰减。在该模型中，尼古丁降低了精子诱导去极化的幅度，允许多余精子进入。这可能解释了海胆中尼古丁暴露与多精受精增加之间的长期关联。虽然尼古丁和冷休克效应的生化途径不同，但两者似乎都通过改变细胞骨架或膜动力学来损害单精受精。
重要的是，冷休克对受精和卵裂的影响是可逆的。这种短暂性在发育结果和电生理特征中都很明显。并非所有冷处理卵都表现出明显的受精电位衰减。这种部分恢复反映在更正的P1膜电位上，表明膜兴奋性在冷暴露后随时间改善，可能由于脂质流动性和离子通道动力学的逐步恢复。恢复可能涉及膜结构和通道行为的重建，因为低温已知会影响脂质双层特性和钠通道功能。
肌动蛋白聚合在受精锥形成和精子进入中起重要作用。有趣的是，冷休克诱导的肌动蛋白动员发生在受精之前，使其位于受精电位上游。相比之下，精子诱导的肌动蛋白聚合在受精后约10秒开始，位于P1下游。两个事件在时间上都不与多精受精的电快速阻断重叠。然而，鉴于肌动蛋白动力学可以调节离子通道活性，冷诱导的肌动蛋白重组可能有助于观察到的受精电位衰减。
虽然肌动蛋白聚合在单精受精或冷诱导的多精受精中都促进精子进入，但此处提供的数据支持一个主要的脆弱性机制：P1期间精子诱导去极化的衰减。这种多精受精快速阻断的部分失活损害了卵子对多余精子的电防御，使冷休克的杂色海胆卵易受多精受精影响。
结论
综上所述，这些发现揭示了在冷应激下多精受精快速阻断中存在一个先前未表征的脆弱性。通过整合电生理数据、发育结果和膜动力学，本研究增进了我们对配子恢复力以及环境调节受精的理解。未来的工作将旨在识别所涉及的分子通道，并定义在环境压力下保护单精受精的生物物理阈值。
材料与方法
实验使用从佛罗里达基比斯卡因海岸外3-5英里的墨西哥湾流收集的海水。使用前经Millipore膜过滤，用10毫摩尔TAPS缓冲，并用1N NaOH调节pH至8.3。所有化学品购自Sigma。
杂色海胆的配子每日采集。通过移除口的部位进行性别鉴定。通过向体腔注射10毫升0.55摩尔KCl诱导雌性产卵。卵子通过将反口面倒置在装有过滤海水的烧杯上来收集。产卵后，卵子用新鲜海水洗涤两次并储存在15°C。雄性性腺被提取，吸干，并在6°C无海水的表玻璃中储存。
为了促进卵子粘附到腔室表面和电极穿透，通过轻柔倒置试管中的卵悬浮液，然后低速离心来去除胶质层。卵子重悬于新鲜海水中，此过程重复直至胶质完全去除。
修改的培养皿盖（60 × 10毫米）包含一个带有中央槽的Sylgard模具，用作记录腔室。重力供应的入口管和抽吸的出口管允许液体交换。腔室安装在Zeiss IM-35倒置显微镜上。
电生理记录遵循先前描述的方案，有轻微调整。卵子使用连接到切换单电极钳制器的微电极穿刺。电流和电压脉冲通过Wavetek 184扫描发生器传递。信号在示波器上可视化并使用Racal 2400S笔式记录仪记录。
浴电极由Ag–AgCl颗粒通过海水中的2%琼脂桥连接组成。微电极从硼硅酸盐玻璃毛细管拉制，尖端用聚苯乙烯树脂在二甲苯中绝缘。电极回填0.55摩尔KCl，电阻在20至50 MΩ之间。
将卵悬浮液置于冰浴中，每1-2分钟轻轻搅拌一次。温度在10分钟内每2分钟记录一次，最后在15分钟时读数。最终温度范围从1.8°C到2.0°C。处理后，卵子在室温（22°C）下恢复15分钟，用新鲜海水冲洗一次，并立即使用。对照卵全程保持在22°C。
为了评估受精结果，对照和冷处理卵在处理后15分钟使用10微升干精子每100毫升海水受精。等分试样在受精后2分钟（用于精子进入计数）或70分钟（用于卵裂评估）用3.1%福尔马林固定。在伴随实验中，受精被延迟以评估恢复。受精膜抬起在精子添加后立即监测。
通过固定卵子，用蛋白酶XIV去除表面结合的精子，并用Hoechst #33342染色来量化精子进入。使用带有荧光光路的Zeiss倒置显微镜在每条件约200个合子中计数荧光精子核。所有计数均在不知处理组的情况下进行。
将卵子加入记录腔室。通过短暂电压振荡实现电极穿刺。仅当卵子表现出稳定的静息膜电位、刺激时具有正超射的动作电位以及输入电阻 > 100 MΩ时才被纳入。这些标准平等应用于对照组和处理组。
通过向穿刺卵附近添加100微稀释精子悬浮液进行受精。电生理反应通常发生在处理后约20分钟。发育结果在受精后1小时评估。
所有定量数据以均值±标准误表示。使用Student's t检验或单因素ANOVA进行统计比较。p值 < 0.05被认为具有统计学意义。样本量和统计检验在图注和结果中指明。
