将脂肪酶固定在经过孔径扩大的SBA-15载体上，并通过甲基（CH3）和氯化锡（SnCl2）基团对其进行异功能化处理，以实现乙酯的生产

时间：2026年1月21日

来源：Microporous and Mesoporous Materials

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本研究通过序贯杂化功能化SBA-15多孔材料（CH3和SnCl），成功制备了Burkholderia cepacia脂酶（BCL）固定化生物催化剂。实验表明，CH3和SnCl协同修饰的SnSS20载体在酯化反应中展现出高活性（90%产率）和优异的重复使用稳定性（第六次循环仍保持75%活性），较单一修饰的BSS20和BSnS20性能更优，且CH3基团有效抑制了酶泄漏。研究证实多级功能化SBA-15载体可同时实现物理吸附和化学共价固定，为开发高效稳定生物催化剂提供了新思路。

C.A. Araki|S.M.P. Marcucci|P.A. Arroyo|G.M. Zanin

巴西巴拉那州马里兰加市马里兰加州立大学（UEM）化学工程系，异相催化与生物柴油实验室

摘要

本文开发了一系列具有扩张孔隙（约20纳米）的有序SBA-15介孔载体，用于固定Burkholderia cepacia脂肪酶（BCL）。这些载体首先用CH₃（SS20）和SnCl基团（SnS20）进行异功能化处理，随后再同时使用这两种基团（CH₃和SnCl，记为SnSS20）。相应的生物催化剂分别命名为BSS20、BSnS20和BSnSS20。本研究的创新之处在于对SBA-15孔隙的顺序异功能化处理，旨在结合疏水吸附和共价固定的优点。水解实验表明，即使经过锡的修饰，CH₃基团的疏水性仍对催化性能有积极影响。在合成乙酯的过程中，所有生物催化剂在72小时后的酯产率均达到约90%。然而，BSnS20和BSnSS20达到反应平衡的时间（48小时）比BSnS20更短，这表明CH₃基团促进了反应速率的提高。向反应介质中添加甘油后，BSS20和BSnSS20的性能有所下降。异质性测试表明，CH₃基团的引入足以防止蛋白质的渗出。用SnCl进行活化对生物催化剂的重复使用非常重要。在第六次测试中，BSnS20和BSnSS20的相对产率分别保持在81 ± 1.0%和75 ± 1.2%，显著优于BSnS20（64 ± 0.4%）。这些结果表明，合成的载体能够在保持通道结构的同时，通过吸附和共价结合的方式有效容纳BCL生物分子，从而实现高活性和操作稳定性的提升。

引言

随着对绿色工艺的兴趣日益增长，全球酶市场显著扩张，2021年市场规模达到114.7亿美元，预计2022至2030年的年增长率约为6.5% [1]。酶是在温和条件下（如生理pH值、大气压和室温）具有催化活性的蛋白质 [2]。这些生物催化剂以其高特异性和选择性而著称。然而，与化学催化剂相比，酶通常成本更高，且分离和回收更为困难 [2]。为了解决这些问题，将大分子固定在多孔载体（如ZSM-5、MCM-41、SBA-15以及皱纹硅和介孔蜂窝泡沫等硅材料）上已成为广泛采用的策略 [2]、[3]、[4]、[5]、[6]。

SBA-15（Santa Barbara非晶数 15）是一种具有优异性能的多功能固体，如高表面积（690–770 m²/g）、明确的孔结构、可调节的孔径以及表面化学修饰的潜力。这些特性使其适合开发活性高且稳定的生物催化剂 [2]、[7]。蛋白质大分子在介孔硅上的吸附可以是物理吸附或化学吸附，具体取决于表面存在的官能团 [2]。

物理固定是通过范德华力、氢键以及载体与酶的氨基酸残基之间的静电或疏水相互作用实现的 [8]。尽管这些相互作用在防止酶在水介质中渗出方面效果较差，但它们通常能产生高活性的生物催化剂，因为它们对大分子的三维结构影响较小 [9]。

相比之下，化学固定涉及载体表面与赖氨酸（Lys）的侧链、谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的羧基、半胱氨酸（Cys）的巯基以及丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）的羟基之间形成共价键。这种方法显著降低了酶脱落的风险，但可能会限制蛋白质结构的流动性，从而导致酶失活 [8]、[9]、[10]。为了形成这种性质的键，需要对载体进行功能化处理，然后使用特定试剂进行活化，例如使用二氯化锡（SnCl₂） [11]。SnCl₂与载体的表面硅醇基团（Si-OH）反应，生成功能基团中心（Surface-O-Sn-Cl） [11]。这些Sn位点随后能够与脂肪酶半胱氨酸残基中的巯基（-SH）形成共价键（Cys-S-Sn-O-Surface） [11]。

尽管物理固定和化学固定各有优缺点，但文献中报道了许多使用这两种方法在SBA-15上固定酶的成功案例。这些制备的生物催化剂的应用范围广泛，从多环芳烃的生物降解到萜类酯、ω-3脂肪酸和生物柴油（脂肪酸烷基酯）的生产 [12]、[13]、[14]、[15]。

生物柴油的生产作为石油基燃料的可持续替代品备受关注 [16]。脂肪酶在甘油三酯的酯交换反应或游离脂肪酸的酯化反应中起催化作用，这两种反应均需要在醇的存在下进行。使用甲醇或乙醇分别生成相应的甲酯或乙酯 [16]。利用脂肪酶的优势包括操作简单、反应条件温和、酒精消耗低，以及能够使用高游离脂肪酸（FFA）含量的原料 [16]。

特别是在脂肪酸烷基酯的合成中，为防止甘油（主要反应副产物）在生物催化剂上的吸附导致性能下降，一种常用的策略是用有机硅烷对载体进行修饰 [17]。通过这种处理，载体结构中的亲水基团被疏水基团（如辛基和甲基）取代，这还可以引起脂肪酶（甘油酯水解酶，E.C. 3.1.1.3）的构象重排 [18]。这些酶具有一个疏水“盖子”，即覆盖酶活性部位的柔性α-螺旋结构 [18]。因此，用疏水基团修饰载体表面可以促进界面活化并扩大活性部位的暴露范围 [6]、[18]。

研究还表明，可以结合物理吸附和化学吸附的优点 [19]、[20]、[21]。Cazaban等人 [22] 发现，固定在经过辛基三甲氧基硅烷和甲基二乙氧基硅烷修饰的硅胶上的Thermomyces lanuginosus脂肪酶，在从菜籽油合成脂肪酸甲酯的过程中达到了88%的最大产率，比商用固定酶（Lipozyme® TL）的产率高出10%。

与固定酶相关的一个问题是由于传质问题导致生物催化剂活性下降。一些作者认为，为了获得高活性和稳定性的固定衍生物，载体的理想孔径应为蛋白质大分子回转半径的3到5倍，这样酶可以牢固地固定在载体内部，同时不影响其在反应介质中的扩散 [4]、[23]。

固定化脂肪酶催化的生物柴油生产一直是研究的重点，最近的研究集中在改进载体设计以优化生物催化剂的性能 [24]、[25]。当前的创新旨在为酶创造一个高度保护性的微环境。例如，Suo等人 [25] 将脂肪酶固定在嵌入Cu（PABA）MOFs的磁性纤维素上，这种MOF保护层提高了稳定性，使生物柴油产率达到78.4%。在另一项研究中，Xu等人 [24] 使用基于氨基酸的离子液体对MOFs进行表面功能化，使活性恢复了高达162%，并且可重复使用性非常好（十次循环后剩余活性为84.4%）。这些最新研究表明，关键策略是使用功能性材料和混合材料来保护酶并提高其催化性能。

因此，在本研究中，合成了具有扩张孔道的SBA-15，并对其进行了CH₃和SnCl的异功能化处理，以及先CH₃后SnCl的处理，以固定Burkholderia cepacia脂肪酶。所选酶的尺寸约为30 Å × 40 Å × 50 Å，能够抵抗短链醇的侵蚀 [26]、[27]。这些生物催化剂用于通过乙醇与脱胶大豆油的反应来生产乙酯。选择乙醇作为可再生原料（来自农业资源，在巴西广泛可用），并结合较少加工的脱胶大豆油，从经济角度来看是一个有吸引力的选择 [28]。最终，这项工作展示了通过结合疏水基团和金属基团的表面修饰，在载体设计方面的重大进展。

材料

来自Burkholderia cepacia的Amano脂肪酶（≥30,000 U/g）、四乙氧基硅烷（≥99.0%，TEOS）、Pluronic P-123、间甲苯（1,3,5-三甲基苯，TMB）和1,1,3,3-六甲基二硅氮烷（HMDS）均购自Sigma Aldrich。二氯化亚锡二水合物（SnCl₂⋅2H₂O）购自Synth。橄榄油来自当地市场，脱胶大豆油由Cooperativa Agroindustrial Cocamar（巴拉那州马里兰加市）提供。所有其他试剂均为分析级。

孔隙扩张SBA-15的合成

孔隙扩张的SBA-15（S20）

载体表征

图1显示了S20、SS20、SnS20和SnSS20样品的IV型（a）等温线及其H1型滞后现象，这些样品具有圆柱形的介孔 [34]。然而，在使用TMB等膨胀剂合成的孔隙扩张SBA-15中，这种等温线可能与笼状孔结构相关，即由圆柱形颈部连接的大球形孔组成，这种结构被归类为介孔硅泡沫（MCF） [38]。

图1的结果表明