3D打印的藻酸盐/明胶/PCL/透明质酸支架结合金属-有机框架用于槲皮素输送：提升机械性能和细胞相容性，以应用于软骨组织工程

本研究设计了一种新型复合水凝胶支架，通过3D打印技术将含藻酸盐、明胶和透明质酸的水凝胶与聚乳酸（PCL）支架结合，显著提升机械强度（杨氏模量>1 MPa）并模拟天然软骨微环境。采用ZIF-8和UIO-66金属有机框架（MOFs）作为载药系统，实现槲皮素靶向递送，其中ZIF-8在抗菌活性（抑菌圈>15 mm）和细胞存活率（>95%）方面表现更优，为软骨组织工程提供了创新解决方案。

Tahoora Naseri|Mohamadreza Soltani|Samira Hosseinian|Amirmohamad Alimohamadi|Mohammad Soleimani|Amir Shamloo|Shohreh Mashayekhan

伊朗德黑兰沙里夫科技大学机械工程学院

摘要

为软骨组织工程应用设计生物相容性支架需要创造一个既能支持细胞存活又能承受机械应力的环境。在本研究中，设计并制备了一种新型混合支架，该支架由3D打印的水凝胶和含有海藻酸盐、明胶及透明质酸的水凝胶墨水组成，并结合了3D打印的PCL支架，对其性能进行了评估。这种设计的创新之处在于它能够提供具有较高机械强度（杨氏模量约为……MPa）的多孔生物相容性环境，优于软骨组织深层（杨氏模量约为……MPa），同时能够在培养24小时后保持软骨细胞的正常存活。ZIF-8和UIO-66金属有机框架（MOF）纳米颗粒被用作抗炎物质槲皮素的载体，通过加载到水凝胶支架上来实现靶向药物输送。ZIF-8的高药物负载量（36%）和UIO-66的高药物负载量（15%），加上可控的降解速率（7天后降解48.64%），有效防止了槲皮素的突然释放。ZIF-8更高的药物释放量使得其对金黄色葡萄球菌的抑制效果更显著（抑制范围约为……mm）。此外，与UIO-66相比，ZIF-8负载的支架在培养24小时后对C28细胞的存活率也更高。这些结果表明，这种具有适当机械强度的支架结合智能药物输送系统，在软骨组织工程应用中具有潜力。

引言

关节软骨是一种特殊的透明结缔组织，存在于每个滑膜关节的表面。由于其固有的柔韧性，它对压缩力具有相当的抵抗力。结合其光滑的表面和润滑特性，它对于支撑负荷、减少摩擦和实现有效的关节运动至关重要（1），（2）。然而，这种类型的软骨容易受到损伤、炎症甚至退行性疾病（如骨关节炎）的影响。这种脆弱性是由于其无血管、无淋巴管和无神经的特性，加上所承受的高机械负荷（3），（4），（5），这限制了其自我修复的能力。因此，关节软骨的修复仍然是一个重大的临床挑战（6），（7）。

组织工程旨在利用材料工程方法和合适的生化试剂来修复受损组织，重点在于开发出类似于天然组织的三维结构环境（8），（9）。在这种方法中，生物支架作为结构支撑，通过模拟细胞外基质来促进细胞的粘附、生长和分化（10），（11）。这些支架通常由水凝胶和天然聚合物等生物相容性材料制成，可以模拟天然软骨组织的机械和生物特性。

合成聚合物（如聚己内酯（PCL）具有良好的机械性能和缓慢的降解速率。加上PCL出色的可打印性，这些特性使其成为模拟天然软骨组织机械和生物特性的理想选择；然而，其有限的生物相容性限制了细胞活性（12），（13），（14）。海藻酸盐（Alg）作为一种天然多糖，由于其优异的生物相容性，为细胞增殖提供了理想的环境（15），（16），（17）。明胶（Gel）是一种从胶原蛋白水解中获得的天然蛋白质，由于其热敏感性和低抗原性，增强了细胞与支架之间的相互作用（18），（19），（20）。透明质酸（HA）是健康透明软骨细胞外基质的主要成分，在软骨组织再生中起着关键作用——尤其是在骨关节炎中——这归功于其生物相容性、生物降解性和抗炎特性（21），（22），（23）。在混合支架设计中将合成聚合物与天然聚合物结合是软骨组织工程应用中的成熟策略（24），（25），（26），（27）。

3D打印是一种强大的工具，能够制造出具有复杂和定制结构的支架（28），（29），（30），（31）。基于挤压的3D打印技术可以精确制造出模仿天然软骨结构和机械特性的患者特异性支架。它通过使用具有适当机械强度的生物相容性材料，创造出仿生微环境（32），（33），（34）。这些支架不仅重建了软骨的天然微环境，还通过促进细胞增殖和分化来提高组织再生的效率（35），（36），（37），（38），（39）。

Chung等人研究了海藻酸盐浓度对3D打印支架可打印性和压缩模量的影响。他们证明，4%海藻酸盐/10%明胶的墨水组合是用于组织工程应用的可靠选择。打印出的水凝胶支架的压缩模量远低于关节软骨组织（40）。Marchioli等人研究了用于生物打印应用的墨水中海藻酸盐、明胶和透明质酸的组成，发现4%海藻酸盐/0.5%透明质酸的墨水在7天的细胞培养中表现出更高的细胞存活率（41）。3D打印水凝胶的机械性能与天然软骨组织之间存在明显差距。以往的研究主要集中在将水凝胶支架整合到3D打印的PCL中，通过将水凝胶溶液注入多孔PCL支架中来利用PCL的高机械强度。然而，这种方法未能在水凝胶-PCL混合支架内提供完全多孔的环境（42）。

近年来，使用载药纳米颗粒进行靶向药物输送被提议作为治疗各种血管疾病和不同类型癌症的替代疗法（43），（44），（45），（46）。MOFs因其高孔隙率、高药物负载量和可控释放特性，在软骨损伤的治疗中展现出巨大潜力，尤其是ZIF-8和UIO-66（46），（47），（48），（49）。由于ZIF-8对pH值的敏感性，它被认为是用于酸性环境（如骨关节炎或炎症环境）中靶向输送药物的良好候选者。UIO-66因其在药物持续释放方面的优异性能和生物相容性而受到关注（50），（51），（52），（53），（54），（55）。Zhu等人（50）发现，使用PC@ZIF-8@PDA/SerMA水凝胶封装自体软骨细胞能有效修复兔关节软骨缺陷。Sadek等人的另一项研究（56）发现，植入UIO-66纳米材料对骨缺陷的愈合过程有促进作用。

在软骨组织工程应用中，感染的风险限制了植入支架的成功，因为感染可能导致炎症和移植物失败。因此，支架的抗菌性能是一个关键参数，因为它们有助于防止植入部位的微生物定植。将抗菌剂掺入支架中可以为细胞增殖和存活提供有利的环境。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化和抗炎作用，在软骨组织工程应用中显示出良好的前景。除了抗氧化和抗炎效果外，槲皮素还表现出显著的抗菌活性，能有效抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（57）。Zhu等人（58）证明，将槲皮素掺入可注射水凝胶中显著增强了口面部间充质细胞的软骨生成分化。这种载有槲皮素的水凝胶促进了软骨细胞的增殖，维持了软骨特异性基因表达，并保护细胞免受氧化应激和炎症的损害（59）。

本研究介绍了一种优化的三维打印混合支架，该支架由海藻酸盐、明胶和透明质酸水凝胶与打印的PCL框架组成，适用于软骨组织工程应用。这种设计提供了多孔且生物相容性的环境，以支持细胞存活，同时力求达到与天然软骨相当的范围的机械性能。为了实现可控的药物释放，支架的水凝胶相加载了含有抗炎和抗氧化药物槲皮素的ZIF-8和UiO-66纳米载体。使用纳米载体是为了解决槲皮素在水环境中的低溶解度和化学不稳定性问题，从而减少水凝胶支架环境中的药物降解，并在靶向释放前防止生物活性的损失（60）。在这种框架下，ZIF-8能够在炎症条件或微酸性环境中实现pH响应性释放，而UIO-66由于其更高的结构稳定性，预计能提供更持续和延长的释放曲线（61）。本研究旨在探讨支架的适当机械强度和生物支持的联合效应，并比较ZIF-8和UiO-66纳米载体在支架系统中的性能及其相关的细胞反应。

材料

明胶A型（来自猪皮，分子量：……Da），海藻酸钠（CAS编号：……），氯化钙（Ca……%，CAS编号：……%），N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二酰胺盐酸盐（EDC；分子量：……；Sigma-Aldrich），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；分子量：……；Sigma-Aldrich），聚己内酯（PCL；分子量：……kDa），透明质酸（HA；分子量：……Da）。青霉素/链霉素和胎牛血清（FBS）从BIO-IDEA购买，二甲基亚砜、戊二醛（GA）和甲醇从Sigma-Aldrich购买。

支架表征

如图1所示，设计了三种支架模型。图1.A展示了使用3D打印方法制造Alg/Gel/HA（PH）支架的过程。图1.B和图1.C分别展示了水凝胶溶液的打印过程和所得到的水凝胶支架。为了提高支架的压缩强度（这是软骨组织工程应用中的关键因素），如图1.D所示，开发了一个PCL模具。随后，将Alg-Gel-HA溶液注入其中

结论

在我们之前的研究中，已经制造了不同的支架用于修复组织损伤（25），（65），（82），（83），（133），（134）。在本研究中，使用基于挤压的3D打印技术，结合海藻酸盐、明胶和PCL以及HA，以三种结构配置制造了三维复合支架，以模拟天然软骨的分层结构。其中，P-H-PCL支架表现出优异的机械性能，压缩强度为2.038 MPa，杨氏模量为……

CRediT作者贡献声明

Amir Shamloo：撰写——初稿，监督，方法学，数据分析，概念化。Mohamadreza Soltani：数据管理，数据分析，研究，方法学，可视化，撰写——审阅与编辑。Tahoora Naseri：数据管理，数据分析，研究，方法学，撰写——初稿，撰写——审阅与编辑。Amirmohamad Alimohamadi：方法学，可视化，撰写——审阅与编辑。Samira Hosseinian：数据管理，数据分析，

财务与利益冲突披露

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数据可用性

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利益冲突声明

本手稿不存在利益冲突。