纳洛酮通过人体呼吸道上皮组织的生物药学评估：一种基于色谱-质谱的方法，结合云雾技术进行气溶胶给药与输送

纳洛酮鼻腔给药的LC-MS/MS方法开发及渗透行为研究，建立同时定量纳洛酮、N-氧化物和诺氧美隆的稳定指示方法，应用于合成膜和人类EpiAirway™模型，揭示纳洛酮在两种介质中的渗透动力学差异。

塔斯敏·阿拉·苏尔塔娜（Tasmin Ara Sultana）| 迪亚·沙克利亚（Diaa Shakleya）| 达斯汀·G·布朗（Dustin G. Brown）| 帕特里克·J·福斯蒂诺（Patrick J. Faustino）| 穆罕默德·阿什拉夫（Muhammad Ashraf）| 艾哈迈德·齐丹（Ahmed Zidan）

美国食品药品监督管理局（US FDA）药物质量研究办公室（Office of Pharmaceutical Quality Research, OPQ, CDER）

摘要

了解纳洛酮（naloxone）的渗透特性对于优化鼻腔给药方式以及支持鼻腔药物产品的比较评估至关重要。在这项研究中，我们开发并验证了一种稳定性指示型液相色谱-质谱（LC–MS/MS）方法，用于同时定量纳洛酮及其相关杂质——纳洛酮N-氧化物（naloxone N-oxide）和诺罗克西莫芬（noroxymorphone）在体外渗透测试（IVPT）受体介质中的含量。该方法被应用于在有限剂量条件下，通过基于云技术的雾化给药方式，研究纳洛酮在合成Nuclepore膜和分化的人类EpiAirway™黏膜纤毛组织模型中的渗透情况。分析结果显示，在Dulbecco磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s phosphate-buffered saline）和Krebs–Ringer碳酸氢盐缓冲液（Krebs–Ringer bicarbonate buffer）中，纳洛酮的浓度在0.25–20.0 ng/mL范围内呈线性分布，且准确性和精密度均符合要求。渗透样品中未检测到降解产物或其他杂质，这证实了该方法的稳定性指示能力。纳洛酮在合成膜中的渗透速度较快，而在上皮组织模型中的传输速度则较慢并趋于平稳，这反映了生理屏障的作用。将基于云技术的雾化给药方式与经过验证的LC–MS/MS平台相结合，有助于从机制上评估纳洛酮的鼻腔渗透情况，并为制剂表征和比较评估提供了体外研究框架。

引言

阿片类药物危机仍然是美国的一个公共卫生问题。2022年，有超过82,000人因阿片类药物过量服用而死亡，占所有药物相关死亡人数的76%以上，其中大部分是由芬太尼（fentanyl）等合成阿片类药物引起的，这些药物通常与可卡因（cocaine）和甲基苯丙胺（methamphetamine）等兴奋剂共同使用[1]。纳洛酮是一种高亲和力的μ-阿片受体拮抗剂，是逆转阿片类药物引起的呼吸抑制的首选干预措施。纳洛酮能够在中枢神经系统（CNS）受体上取代阿片类药物激动剂，从而迅速恢复正常的呼吸功能；重要的是，纳洛酮的作用不会逆转由苯二氮卓类药物（benzodiazepines）等非阿片类药物引起的CNS抑制[2][3]。尽管纳洛酮通过静脉或肌肉注射后作用迅速，但其半衰期相对较短（30至81分钟），因此在涉及长效阿片类药物时往往需要重复给药。纳洛酮在肝脏中经过葡萄糖醛酸化作用形成纳洛酮-3-葡萄糖醛酸苷（naloxone-3-glucuronide），并通过肾脏排出体外，即使在肝功能受损的患者中仍具有良好的肝脏安全性[2]。此外，由于首过代谢作用，纳洛酮的口服生物利用度较低[4]。

为了提供更便捷、无创的给药方式，已经开发出了纳洛酮鼻喷雾剂，如Narcan（4 mg）、RiVive（3 mg）、Kloxxado（8 mg）和通用型盐酸纳洛酮（4 mg），并获得了FDA的批准[5][6]。这些产品适用于非医疗人员使用，其相对系统生物利用度约为43–54%，使其非常适合用于紧急阿片类药物过量情况[7][8]。尽管在给药方式上取得了进展，但纳洛酮在制剂中的稳定性仍是一个值得关注的问题。氧化、光解和热降解可能产生纳洛酮N-氧化物和诺罗克西莫芬等杂质，如果这些杂质含量较高，可能会抵消纳洛酮的作用[9][10][11]。因此，在产品开发和整个保质期内，需要采用灵敏度高且选择性的分析方法来检测和控制这些杂质[12][13]。

开发灵敏度高且选择性的分析方法面临多重挑战。首先，纳洛酮及其杂质在体外渗透测试（IVPT）受体介质中的浓度通常非常低，仅以皮克（picograms）到纳克（nanograms）每毫升计。LC–MS/MS方法可以实现所需的低定量限（例如，纳洛酮为0.01 ng/mL，纳洛酮N-氧化物和诺罗克西莫芬为0.25 ng/mL[13]），但将这些方法应用于DPBS和KRBB等IVPT介质时会带来新的挑战。具体来说，这些体外介质可能会在电喷雾离子化过程中引起离子抑制或增强现象。为减轻这些介质效应，分析程序应包括与介质相匹配的校准、全面的介质效应评估以及使用稳定同位素标记的内标[14]。此外，纳洛酮及其杂质具有相似的化学结构，这使得色谱分离技术上具有挑战性。通常需要高分辨率的反相柱（如EC-C18、苯基-己基柱）和优化的梯度洗脱条件才能实现必要的分离[15]。

化学稳定性也是一个问题。由于纳洛酮容易发生氧化、光解和热降解，样品处理过程中应采取低温储存、添加抗氧化剂和避光等措施以减少杂质生成[16]。此外，像纳洛酮N-氧化物和诺罗克西莫芬这样的高极性分析物在常规反相柱上的保留能力较差，通常需要使用亲水相互作用色谱法进行准确定量[10][17]。此外，大多数已发表的分析方法都是针对血浆、尿液或肝微粒体设计的，可能无法直接应用于IVPT受体介质。这种转移需要定制的样品制备策略，如固相萃取和介质添加，以确保结果的准确性和可重复性[12][18]。这些分析要求符合FDA和ICH M10指南的要求，即需要经过验证的、能够定量指定阈值以上分析物的稳定性指示方法[19]。鉴于这些分析、监管和制剂方面的挑战，本研究旨在验证一种灵敏度高、选择性强且能指示稳定性的LC–MS/MS方法，用于在IVPT受体介质（DPBS、KRBB）中同时定量纳洛酮、纳洛酮N-氧化物和诺罗克西莫芬，以评估纳洛酮通过基于云技术的雾化给药方式在人体呼吸上皮组织中的渗透情况。该程序应用于使用Vitrocell® Cloud Alpha 12系统进行的人工膜和生物学相关EpiAirway™黏膜纤毛组织的渗透研究。

材料

Narcan（纳洛酮盐酸盐）鼻喷雾剂（4 mg/0.1 mL）由Emergent BioSolutions（美国马里兰州罗克维尔市）提供。参考标准品（纳洛酮、纳洛酮N-氧化物、诺罗克西莫芬、纳洛酮-d5）、甲酸和Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液从MilliporeSigma（美国马里兰州罗克维尔市）购买。乙腈和醋酸铵从Fisher Scientific（美国新罕布什尔州汉普顿市）购买。甲醇来自Alfa Aesar（美国马萨诸塞州哈弗希尔市），水来自Honeywell Burdick & Jackson（美国密歇根州马斯基根市）。

LC-MS/MS分析方法的开发和优化

分析方案经过系统优化，能够在IVPT受体介质（DPBS、KRBB）中同时定量纳洛酮、纳洛酮N-氧化物和诺罗克西莫芬，达到ICH/FDA指南要求的痕量级灵敏度、重复性和通量，适用于渗透性和杂质研究[20]。采用正模式电喷雾离子化（ESI+），通过直接注入标准溶液（纳洛酮、纳洛酮-d5）来优化前体离子和产物离子的转化。

结论

我们开发并验证了一种灵敏度高、选择性强且能指示稳定性的LC–MS/MS方法，用于在IVPT受体介质中定量纳洛酮、纳洛酮N-氧化物和诺罗克西莫芬。该方法应用于通过基于云技术的雾化给药方式，在合成Nuclepore膜和分化的人类EpiAirway™黏膜纤毛模型中研究纳洛酮的渗透情况，观察到了不同的渗透行为。

伦理批准声明

本研究未涉及人类参与者或动物，使用了市售的体外组织模型。

作者贡献声明

帕特里克·J·福斯蒂诺（Patrick J. Faustino）：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。达斯汀·布朗（Dustin Brown）：撰写、初稿编写、方法学设计、实验实施。迪亚·沙克利亚（Diaa Shakleya）：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法学设计、数据分析、概念构思。塔斯敏·阿拉·苏尔塔娜（Tasmin Ara Sultana）：撰写、审稿与编辑、初稿编写、方法验证、方法学设计、实验实施、数据分析。艾哈迈德·齐丹（Ahmed Zidan）：撰写、审稿与编辑、初稿编写、监督。

利益冲突声明

作者均为政府雇员或承包商，声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了美国食品药品监督管理局（US FDA）药物评估与研究中心（Center for Drug Evaluation and Research）控制物质计划（Controlled Substances Program）的资助。作者感谢Juliana Quarterman和Manar Al-Ghabeish在Vitrocell® Cloud Alpha 12系统的安装和培训方面提供的帮助。该项目还得到了Tasmin Ara Sultana被任命为CDER研究参与计划成员的支持。