摘要
藻类草皮是由毫米至厘米级的海洋绿藻、褐藻和红藻组成的群落。由于其个体微小，它们既未得到大型海藻分类学家的深入研究，也因通常关注更小的单细胞类群而落在微藻分类学家的研究范围之外。草皮藻类结构简单，形态常趋同，具有匍匐和直立轴。因此，草皮中存在大量未被记录的藻类生物多样性，多项分子调查已证实此点。本研究旨在探索可加速发现和描述微小草皮物种的整合分类学方法。我们聚焦于蕨藻科中一个体型极小的绿藻属——伪德氏藻属。我们结合野外采集样品的多焦点成像、微样本基因组学和培养技术，记录了大堡礁鹭岛的伪德氏藻生物多样性。基于rbcL和tufA标记基因的算法物种界定表明，伪德氏藻属可能存在六个（可能五个）物种，但迄今仅有两个被描述。我们已将鹭岛发现的两种伪德氏藻正式描述为茂盛伪德氏藻和石生伪德氏藻。后者依据命名法规对显微藻类的例外条款，以多焦点图像作为其主模式标本进行描述。我们从对法规的解释以及为新发现物种命名以促进其在科学、保育和政策中应用的更广泛概念需求两方面，广泛论证了这一选择的合理性。
引言
草皮藻类是指在潮间带和亚潮带海洋环境中常见的一类高度可达数厘米的多样化小型藻类。在珊瑚礁上，它们覆盖了约40%的基底，作为海洋食草动物的食物以及营养循环的场所发挥着生态系统功能。然而，气候变化、过度捕捞和高营养输入均增强了草皮藻类相对于珊瑚的竞争优势。
草皮藻类仅凭形态难以鉴定；它们存在“低形态学问题”，即形态的简单性可能导致形态上无法区分的物种。基于DNA的方法有助于区分此类困难类群中的物种，并已成为许多藻类研究中的主要物种界定标准。例如，Díaz-Tapia和Verbruggen在多管藻物种复合体内描述了八个独立的物种，其中一些在形态上无法区分。这种情况并不罕见，许多其他研究也表明，形态定义的草皮藻类物种包含大量的隐性生物多样性。
草皮藻类的物种描述速度受到多种因素限制。首先，它们体型微小，常被专注于大型类群的海藻分类学家忽视。在体视镜下分选草皮藻类十分耗时费力，且多种物种常交织生长，增加了分选难度。其次，其微小体型限制了可用材料所能进行的研究。对于海藻整合分类学，通常做法是将部分藻体保存于硅胶中用于DNA分析，另一部分保存于液体固定剂中用于解剖观察，剩余标本压制成标本馆凭证标本。这对草皮藻类而言不可行，因为它们太小了。考虑到草皮中可能存在许多形态相似的物种，在单次收集中将多个个体归为一组时需谨慎。有时可分离培养菌株以获取更多材料，从而允许进行更多类型的分析和保存方法。
本研究聚焦于伪德氏藻属，一种出现在热带草皮中的管状绿藻。其形态简单，由从水平“匍匐”管状体上产生的二叉分枝直立管状体组成，并有短的假根管状体将藻体附着于基底。伪德氏藻尤其微小：自然界中观察到的大多数藻体仅几毫米高，在野外通常不易直接观察到，而是在用体视镜检查大型藻类或其他基底时被发现。
目前仅描述了两种：来自哥伦比亚的树状伪德氏藻和来自西澳大利亚的昆布伪德氏藻。伪德氏藻亦在加那利群岛和希腊罗德岛被采集到，但这些样本未被鉴定到种，因为研究人员认为关于该属的信息不足。通过环境DNA测序，也从路易斯安那州和夏威夷获得了伪德氏藻的DNA序列。
本文的目标是探索加速草皮藻类发现和描述的方法，重点研究鹭岛（大堡礁）的伪德氏藻生物多样性，并更广泛地评估该属内的物种多样性。
材料与方法
研究团队两次前往大堡礁南部的鹭岛采集伪德氏藻。由于单个伪德氏藻藻体极其微小，处理材料的选项非常有限，因为单个丝状体太小，无法同时满足DNA和形态学研究的保存需求。在2017年2月的首次考察中，采用的方法是在野外实验室对野外采集的伪德氏藻丝状体进行成像，然后将整个丝状体用于DNA提取，进行下游的高通量测序，本文中称此方法为微样本基因组学。使用Leica EZ4 HD体视显微镜的内置相机在不同焦深下拍摄照片，并在Affinity Photo v.2中生成焦点堆栈图像。在2023年4月的第二次考察中，重点在于建立丝状体的培养物、观察材料，并在生长一段时间后进行DNA提取。原始和焦点合并图像已提交至本研究相关的Zenodo存储库。
培养物在摇床上的50毫升培养瓶中使用F/2培养基，于26°C、12:12小时光暗周期（16 μmol photons·m−2·s−1）下培养。将未被污染的小段藻体定期移至新容器，有时使用无维生素培养基以控制细菌生长。项目结束时，所有剩余培养材料用100%乙醇杀死并存放于墨尔本大学植物标本馆。
DNA提取采用改进的Doyle和Doyle CTAB提取方案。对于某些样本，进行了修改，包括在65°C下过夜孵育、增加第三次氯仿:异戊醇提取、将异丙醇沉淀步骤延长至过夜，以及不进行RNAse处理。使用VAHTS universal DNA kit制备Illumina文库，并在NovaSeq平台（150 bp 双端测序）上进行测序。使用fastp v0.24.0默认设置对 reads 进行过滤和修剪，并使用Megahit v1.2.9进行组装，然后从组装结果中提取rbcL和tufA基因序列（这些基因在伪德氏藻及相关属中已被用作DNA条形码）。对于部分样本，使用聚合酶链式反应（PCR）扩增rbcL基因，并对该基因进行Sanger测序。除大堡礁材料外，还获取了来自罗特尼斯岛的昆布伪德氏藻额外样本，并进行了上述Illumina测序。所有样本的rbcL和tufA基因序列已提交至GenBank，从组装结果中提取的叶绿体基因组contigs已提供在Zenodo存储库中。原始测序数据已提交至序列读取档案库。
使用MAFFT v7.490进行多序列比对。除澳大利亚序列外，比对结果还包括GenBank中所有伪德氏藻的tufA和rbcL基因序列，以及来自夏威夷的一个rbcL基因序列。外类群序列为蕨藻科另外两个属（南极拉姆藻和羽藻）的rbcL和tufA基因序列。
对单基因比对结果运行了三种物种界定算法：自动分区组装物种、广义混合Yule聚结模型和泊松树过程。ASAP使用其命令行版本及默认参数运行。对于PTP分析，使用IQ-Tree 1.6.12基于单基因比对推断最大似然系统发育树，最佳模型由ModelFinder确定：rbcL为TIM2+F+Γ4，tufA为TIM2+F+Γ4。使用UFBoot2软件包进行1000次重复计算获得自举值。使用bPTP命令行版本推断物种边界。对于GMYC，由于该软件在存在相同序列时存在已知的优化问题，对相同序列进行去重仅保留最长拷贝，并使用BEAST v.1.10.4创建超度量树，模型为未关联的对数正态松弛钟模型、恒定大小的聚结树先验，以及100万次马尔可夫链蒙特卡洛迭代。丢弃前一半MCMC样本作为老化期后，推导具有中位数节点高度的最大分支可信度树。使用R软件包splits运行广义Yule平均聚结物种界定。
为获得包含所有物种的单一系统发育树，使用物种界定算法建议的每个物种的单个样本的rbcL和tufA基因序列创建串联比对。对于仅知一个基因的物种，则使用该单基因纳入。使用IQ-Tree 1.6.12基于串联比对生成ML树，模型采用内置ModelFinder确定的TIM2+F+I+G4模型，并进行500次标准自举分析。
结果
从2017年的考察中，通过第一种方法（即对丝状体拍照后将其全部用于DNA提取）获得了三个伪德氏藻样本的rbcL和tufA基因序列。在2023年的采集行程中，在鹭岛所有调查地点均观察到具有二叉分枝的微小伪德氏藻状丝状体，它们生长在碳酸钙岩石上，也附生在多种大型藻类上。在野外工作站分离的70多个丝状体中，仅一部分成功运输并在培养中生长。获得了四个培养样本的rbcL和tufA基因序列。
在野外样本中，观察到多种形态，有些标本的直立管状体更纤细、柔韧，而其他的则更坚硬。许多标本存在多层二叉分枝。培养样本形态观察为水平“匍匐”管状体，有规律地产生直立管状体，但在培养的几个月内未观察到直立管状体的任何二叉分枝。培养物中直立管状体之间的节间长度约为5毫米，而直立管状体高度约为8毫米。假根管状体成对出现，从直立管状体正下方的匍匐管状体两侧长出。假根管状体长约1毫米，将藻体附着在培养瓶壁上。培养藻体生长稀疏，与自然环境中的生长形态形成对比。
微样本基因组学HTS数据的组装产生了叶绿体基因组草图。结合先前工作的rbcL和tufA基因序列、培养物的Sanger测序序列以及微样本基因组学数据中的候选质体contig，用于推断物种边界。对于rbcL基因，物种界定分析一致地识别出五个物种。只有昆布伪德氏藻可明确赋予现有名称，因为其中一个序列来自主模式标本。其余物种级谱系包括下面将描述的两个大堡礁物种，以及来自夏威夷的sp.1和来自希腊的sp.2。在tufA基因数据中（缺少夏威夷实体但包含一个来自路易斯安那的额外序列），PTP和GMYC建议五个物种，ASAP建议四个物种。其中四个也存在于rbcL数据中（茂盛伪德氏藻、石生伪德氏藻、昆布伪德氏藻和sp.2），第五个来自路易斯安那的被指定为sp.3。来自2017年和2023年鹭岛考察的序列（源自培养物和野外提取的DNA）聚类成两个独立的物种：一个由两个野外提取DNA序列组成，另一个则由培养物和野外提取DNA组合而成。
基于串联的tufA和rbcL基因序列的系统发育分析产生了一棵许多节点支持度相对较高的树。然而，少数其他节点的分辨率较低。这些不稳定的分支可能部分是由于某些物种存在缺失数据（sp.1仅有rbcL，sp.3仅有tufA）。从串联树和单基因拓扑结构来看，下面描述的第一个新种和sp.1形成了相对早期的分支谱系，而sp.2、sp.3、第二个新种和昆布伪德氏藻似乎源于一次更近期的辐射。
讨论
伪德氏藻中未被认识的生物多样性
目前，伪德氏藻属的研究非常不足，全球仅有四份标本有论文详述，仅两个物种被正式描述。我们的结果清晰地表明伪德氏藻中存在先前未被认识的生物多样性，分子物种界定结果指示可能存在六个（最少五个）物种。三种物种界定方法在大多数情况下的物种边界划分结果相互一致。
然而，希腊和路易斯安那样本的tufA基因序列被PTP和GMYC划分为不同物种，而ASAP将它们归为一类。为了给这些分子物种边界提供更多背景信息，我们比较了这些假设物种之间的距离与在更深入研究的蕨藻目属中密切相关的物种对之间的距离。希腊和路易斯安那伪德氏藻样本之间的未校正距离（p-distance）为5%。在蕨藻属中，Belton等人认可的密切相关的物种对之间的分歧要小得多，范围在0.34%到1.06%之间。类似地，在扇藻属中，密切相关但形态差异很大的物种对之间，tufA基因的未校正成对距离为1.1%–1.4%。这些距离比较表明，这两个伪德氏藻序列很可能属于不同的物种，我们依此进行了标记。但我们认识到跨类群应用距离阈值的局限性，以及该部分系统树中已测序样本数量极少，因此我们的决定不应被视为对此问题的最终结论。
尽管我们主要依赖分子序列进行物种界定，但工作的一个重要方面是记录野外采集的标本。我们的方法使用了多焦点体视镜成像，产生了能充分捕捉所研究微小物种主要形态特征的详细图像，允许与其他物种进行比较，并在模式指定中发挥了关键作用。
描述两个大堡礁物种
对于大堡礁样本，所有分子物种界定方法一致地识别出两个明显分离的物种。与伪德氏藻sp.2 + sp.3聚类群相比，这两个澳大利亚实体显然是更古老的谱系，并且都与其它分类单元分化良好。因此，我们正式描述以下两个物种：
茂盛伪德氏藻
描述： 该物种主要根据其rbcL和tufA基因序列定义，这些序列在系统发育分析中与所有其他已知伪德氏藻物种不同。藻体具匍匐轴和直立轴，通过伸长的假根附着于基底。在野外采集的材料中，直立部呈二叉分枝，从基部到藻体顶端逐渐变细，基部宽40–63微米，藻体中部宽32–36微米，顶端约30微米处宽10–15微米。直立部高2.5–3.9毫米。
主模式标本： 指定代谢失活的培养物MC26为主模式标本。原始材料由Myles Courtney于2023年4月8日采集自澳大利亚昆士兰州鹭岛，水深约1米。存放于墨尔本大学植物标本馆。
词源： 以该物种茂盛的形态命名。
生境： 观察到附生在多种海藻上，生长于浅水潟湖生境。
检查标本： HV06621b、MC18、MC19、MC26、MC37。
石生伪德氏藻
描述： 该物种主要根据其rbcL和tufA基因序列定义，这些序列在系统发育分析中与所有其他已知伪德氏藻物种不同。藻体具匍匐轴和直立轴，通过伸长的假根附着于基底。管状体直径从基部（30–55 (−65) 微米）向顶端（16–30微米）逐渐变细，藻体中部测量值为26–38微米。其锥度变化不如其他伪德氏藻物种明显，管状体末端比其他伪德氏藻物种更钝。分枝相对稀疏。直立部高1.6–2.2毫米。
主模式标本： 样本HV06710的图像（图1b）作为该物种的主模式标本。没有实体标本可用作主模式标本，因为所有可用材料均在DNA提取中消耗。该材料由Heroen Verbruggen于2017年3月3日采集自澳大利亚昆士兰州鹭岛，水深约16米。
词源： 以该物种的石生习性命名。
生境： 该物种生长在钙质礁石基底上，通常在覆盖有壳状珊瑚藻的碎石上。我们的两次采集来自礁坡的较深水层。
检查标本： HV06614a、HV06710。
命名决定的理由
我们决定使用图像而非凭证标本作为主模式标本来描述石生伪德氏藻这一新种。我们意识到这很可能是一个有争议的决定，需要援引《国际藻类、菌物和植物命名法规》（马德里法规）中一条很少使用的规则。我们依据马德里法规第40.6条为石生伪德氏藻的有效发表提供理由。两个关键短语——“显微藻类”和“标本保存的技术困难”——需要论证。首先，我们论证该物种是显微藻类。其藻体是非常细的丝状体，直径仅几十微米，丝状体高度仅约2毫米。因此，它肯定无法在野外被识别，只有在收集碎石并在体视镜下观察时才能看到丝状体。其次，我们论证技术困难阻碍了标本保存。可用材料量非常少，使用我们所采用的DNA提取方法，需要全部材料才能获得足够的DNA进行低输入量的文库制备。有人可能认为可以通过培养来增加材料量。这是一个有效的论点；然而，我们在2023年的考察中尝试过，但尽管石生伪德氏藻与成功培养的茂盛伪德氏藻在完全相同条件下培养，尝试结果仍是藻类生长失败和死亡，表明石生伪德氏藻存在培养技术困难。有人可能认为草皮藻类可以很容易地制成显微镜载玻片标本保存。在大多数情况下确实如此；然而，这些伪德氏藻样本过小（2毫米），不允许在DNA提取之外再制作永久载玻片。这引出了更广泛的障碍：未来在同一生境采集到同一物种的任何样本都将面临同样的困境。要么制作永久载玻片，但无法有把握地将该菌株归属于某个分子谱系；要么进行DNA提取，但放弃保存实体凭证。因此，阻碍实体主模式标本的不仅是我们采集材料的缺乏，也是该物种的一个特征。
对于茂盛伪德氏藻，情况更直接，因为我们有一个培养标本（现已死亡并干燥）作为主模式标本。必须注意的是，该培养物不能代表物种在自然界中的外观，因为它表现出更稀疏的生长习性且直立部无分枝。图1c的插图更好地展示了该物种在自然环境中生长的情况。
生物地理学和形态学解释
汇编的数据还表明伪德氏藻似乎分布于全球热带和暖
