抗生素的广泛使用保护了人类健康，但也带来了严重的环境残留问题[1]。其中，四环素（TCs）作为最常用的广谱抗生素之一，因其环境行为和生态风险而受到广泛关注[2]。环境中持续存在的TCs残留不仅会导致耐药菌株的出现[3]，还可能通过食物链中的生物积累威胁人类健康[4]。世界卫生组织（WHO）和国家监管机构已经为食品和环境中的TCs制定了严格的最大残留限量。欧盟将牛奶中四环素的最大残留限量设定为100 μg/L[5]。传统的TCs检测方法主要涉及高效液相色谱和液相色谱-质谱等仪器分析技术[6]。虽然这些方法准确可靠，但存在设备昂贵、样品制备复杂和检测周期长等缺点[7]，不适合快速现场检测[8]。因此，建立一种快速、准确且灵敏的TCs检测方法具有重要的实际意义[9]。为了克服上述方法的不足，我们利用适配体、CRISPR/Cas12a和卟啉基金属有机框架，实现了快速、准确和灵敏的四环素检测，为食品中抗生素的快速检测提供了一种新方法。
适配体（Apt）具有分子量低、化学稳定性好、易于合成和修饰[10]以及能够特异性[11]识别各种目标分子[12]等优点。作为监测系统中的目标物质识别元件，适配体在TCs检测中得到广泛应用[13]、[14]。规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas12）在构建传感平台中得到广泛应用[15]、[16]。其中，CRISPR/Cas12a依靠CRISPR RNA（crRNA）识别双链DNA（dsDNA）中的PAM序列，从而激活Cas12a核酸酶活性[17]。或者，crRNA与单链DNA之间的互补结合可以激活Cas12a蛋白的切割活性[18]。这些特性使其在研究中得到广泛应用。先前的研究广泛使用荧光信号进行TCs检测，因为它们具有高灵敏度和安全性优势[19]、[20]、[21]。然而，单模荧光信号输出容易受到复杂背景的干扰[22]。在操作过程中，人为错误、交叉污染和酶降解等问题可能会影响检测结果的准确性。比率荧光传感技术在光学检测中具有显著优势，因为它通过测量两个或多个发射信号的比例而不是单一强度值来实现内部自校准[23]。与传统单信号荧光技术相比，比率荧光传感器通常表现出更高的灵敏度和更强的抗背景干扰能力，从而能够更精确地量化生物、环境和化学系统中的分析物。双发射策略进一步拓宽了动态范围，实现了实时监测，同时减少了假阳性[24]。这些优势使比率荧光技术成为临床诊断、环境监测和即时检测等先进光学传感平台中的强大工具。因此，我们在系统中采用双荧光信号输出模式，显著减少了背景噪声和仪器引起的干扰[25]，从而进一步提高了检测系统的灵敏度和自校准能力[26]、[27]。
选择PCN-224作为MOF平台，是因为它独特地结合了MOF材料的结构优势与卟啉单元的固有光物理性质[28]、[29]。其高度有序的多孔框架和大比表面积使得生物分子（特别是单链DNA）通过π–π堆叠、静电相互作用和配位效应有效吸附[30]。重要的是，PCN-224表现出强而稳定的固有荧光，使其不仅可以作为纳米载体，还可以作为内部光学参考信号[31]、[32]。这种双重功能对于构建具有更高精度和抗环境波动能力的比率荧光系统至关重要[33]。此外，PCN-224优异的化学稳定性和生物相容性确保了其在食品和环境样品等复杂基质中的可靠性能，使其特别适合用于生物传感应用[34]。适配体因其对小分子抗生素的高亲和力和优异的特异性而受到广泛认可，使其成为荧光传感的有吸引力的识别元件。同时，CRISPR/Cas12a提供了可编程的激活和强大的切割活性，为超灵敏检测提供了强大的信号放大能力。为了进一步提高分析可靠性，将双功能金属有机框架PCN-224集成进来，引入了具有内在自校准能力的比率荧光读出。这种组合策略有效地补偿了探针浓度、激发强度和样品基质效应的变化，从而提高了信号的稳定性、准确性和鲁棒性。因此，Aptamer–CRISPR/Cas12a–PCN-224平台能够灵敏且可靠地检测小分子抗生素，并提高了分析性能。
在这项研究中，设计了一种基于比率的荧光传感器来检测TCs，该传感器由适配体和具有荧光特性的CRISPR/Cas12a及金属有机框架（MOF）复合材料组成（图1）。在对PCN-224吸附FAM标记的单链DNA（FAM-ssDNA）及其FAM荧光淬灭机制进行深入研究后，在用作目标识别元素的特定核酸适配体（42TET）的互补链（cDNA）中设计了CRISPR/Cas12a激活序列。在目标序列（TCs）存在下，42TET特异性结合，释放cDNA与crRNA互补结合。这激活了Cas12a的水解酶活性，使其切割FAM-ssDNA。因此，吸附在PCN-224上的FAM-ssDNA被切割，释放出碎片化的FAM-ssDNA到溶液中，恢复FAM荧光。在这个系统中，适配体确保了目标DNA的选择性识别，而释放的cDNA仅在目标存在下触发Cas12a的激活，从而保证了高特异性。Cas12a介导的FAM-ssDNA切割产生目标依赖的荧光恢复信号，而PCN-224的稳定荧光发射作为内部参考。与传统单模CRISPR或基于MOF的传感器相比，这种协同设计显著提高了分析可靠性和定量精度。值得注意的是，这项研究通过将CRISPR/Cas12a技术与卟啉金属有机框架结合，建立了基于比率的检测平台，用于小分子抗生素的检测，填补了研究空白。这一策略不仅扩展了CRISPR诊断的应用范围，还为开发适用于食品安全和环境监测的稳健生物传感器提供了通用框架。
