1 引言
高致病性禽流感（HPAI）A/Goose/Guangdong/1/1996 (Gs/GD)谱系的H5Nx病毒持续对家禽业和全球公共卫生构成重大威胁。2.3.4.4b分支H5N1病毒自2020年出现后已形成全球性动物疫情，宿主范围扩大至多种哺乳动物，引发严重的人畜共患和“同一健康”关切。自2020年起，2.3.4.4b分支H5Nx病毒通过东亚-澳大利西亚候鸟迁徙路线每年在韩国引发冬季疫情，其流行亚型不断演变，出现了H5N8、H5N1、H5N6等。2024-2025年冬季，韩国监测到2.3.4.4b分支H5N1病毒通过野水禽引入，并于2025年3月首次发生对豹猫的哺乳动物外溢事件。为早期检测HPAI病毒，韩国国家野生动物疾病控制与预防研究所（NIWDC）在秋迁期间对高风险迁徙栖息地加强了主动监测。本研究报道了2025年秋迁伊始在野鸟中早期检测到的两株2.3.4.4b分支HPAI病毒H5N1和H5N9，并对其进行了全基因组测序和比较系统发育分析以确定其遗传特征和进化起源。
2 材料与方法
2.1 病毒分离与基因组测序
2025年10月27日至28日，在韩国全罗北道群山市万景江和扶安郡高夫川采集了野水禽的新鲜粪便样本以及口咽和泄殖腔拭子。样本处理后，接种SPF鸡胚进行病毒分离，通过血凝（HA）试验和实时逆转录PCR（rRT-PCR）检测流感A病毒M基因和H5基因。阳性样本通过DNA条形码技术鉴定宿主物种。
2.2 全基因组测序与序列分析
对PCR阳性样本进行全基因组扩增，使用Illumina MiSeq平台进行测序。经过质量过滤和de novo组装后，生成共识基因组序列并提交至GISAID数据库。利用在线工具进行分支分类，并使用FluMut工具分析哺乳动物适应、致病性和耐药性的分子标记。
2.3 系统发育分析
从GISAID数据库获取同源序列，使用MAFFT进行多序列比对，利用RAxML构建最大似然（ML）系统发育树。同时，使用BEAST软件基于HA基因构建时间尺度的系统发育树，估算最近共同祖先（tMRCA）的时间。
3 结果
3.1 病毒分离与鉴定
从万景江采集的66份粪便样本中，检测并分离到一株H5N1 HPAI病毒（A/Common_teal/Korea/25WF154-8P/2025，简称25WF154-8P），宿主为绿头鸭（Common teal）。从高夫川捕获的野鸟拭子样本中分离到一株H5N9 HPAI病毒（A/Common_teal/Korea/25WS011-14/2025，简称25WS011-14）。
3.2 全基因组测序与序列分析
两株病毒均被确认为HPAI病毒（HA切割位点为PLREKRRKR/G），属于H5 2.3.4.4b分支。突变分析显示，两株分离株均携带多个哺乳动物适应标记。25WF154-8P和25WS011-14分别携带29个和28个替代突变。在HA基因中发现了与小鼠毒力增强（S107R, T108I, T134A）和增强与α2-6连锁唾液酸受体结合（T156A, V182N, K218Q, S223R）相关的替代。内部基因片段也携带多个与哺乳动物适应相关的替代。值得注意的是，所有分离株均未发现PB2-E627K或PB2-D701N这两个著名的哺乳动物适应标记。
3.3 系统发育分析
系统发育树显示，H5N1分离株（25WF154-8P）的HA基因属于2.3.4.4b分支的G2c亚谱系。其PB2、PA、NP、NA和MP基因与2022-2023年韩国、越南和中国的HPAI病毒聚类，与22G4（KorP）基因型密切相关，但其PB1基因源自2022年韩国野鸟中的低致病性禽流感（LPAI）病毒，表明该病毒是22G4基因型与LPAI病毒重配的产物。
H5N9分离株（25WS011-14）的HA基因同样属于G2c亚谱系，但其内部基因构成不同。除PB2和NA外，其他基因片段主要与KorD基因型病毒聚类，PB2与22G8（KorC）基因型相关，而NA基因与2023年韩国、日本和俄罗斯的H11N9 LPAI病毒关系密切，表明其是KorD、KorC基因型与H11N9 LPAI病毒重配形成的独特重配株。
基于HA基因的贝叶斯系统发育分析表明，G2c谱系的tMRCA估计为2021年6月6日。2025年的H5N1病毒与2023年中国的一株H5N1病毒（A/Env/Changsha/C23055215/2023）形成一个单系群，其tMRCA为2023年9月30日，表明它们自2023年底分化后在不同传播链中独立演化。
4 讨论
2.3.4.4b分支H5 HPAI病毒与共循环的LPAI病毒持续重配，产生了多样的基因库并在全球传播。2025年检测到的H5N1和H5N9病毒代表了东亚地区HPAI和LPAI基因库之间持续的重配和区域基因交换。H5N9亚型在韩国的出现是该国自2003年有记录以来的首次，凸显了病毒基因多样性的不断扩展。系统发育分析支持这些新检测到的病毒与当前东亚流行的H5Nx病毒谱系相关，并通过区域内的病毒重配产生，其传播与东亚-澳大利西亚候鸟迁徙路线相符。两株病毒均携带多种见于近期东亚HPAI毒株的哺乳动物适应标记，尽管组合不同，且缺乏某些关键标记，但其功能意义需进一步实验验证。与以往疫情季指数病例多见于鸳鸯不同，本次2025-2026疫情季的指数病例于10月秋迁初期在绿头鸭中发现，这种高度移动的候鸟在病毒传播和演化中扮演关键角色。尽管2024年夏季后野鸟中未再检测到HPAI病毒，但2025年秋初在韩国西北部家禽养殖场的零星检测表明，在迁徙季之前可能存在病毒的低水平持续或再次引入。持续的主动监测、快速的基因组表征以及国际数据共享，对于追踪新发HPAI谱系的进化和传播至关重要。
