LNP库的构建与表征
脂质纳米颗粒（LNP）由四种脂质成分组成：可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质缀合物，与核酸复合形成。研究采用实验设计（DOE）方法构建了包含18种LNP的库，这些LNP封装了荧光素酶mRNA（Luc-LNPs）。库中LNP使用C12-200（C12）或DLin-MC3-DMA（MC3）作为可电离脂质，DOPE或DSPC作为磷脂。LNP的流体动力学直径范围为90.3至153.9纳米，多分散指数低于0.2，mRNA包封效率在41.5%至87.1%之间。通过TNS测定法测定的表观pKa值范围为5.3至7.1。分析表明，可电离脂质的类型是影响LNP表观pKa的显著因素。
LNP设计驱动向滋养层细胞的递送
研究使用了三种滋养层细胞系：代表早期妊娠绒毛外滋养层细胞的HTR8/SVneo（HTR8），以及代表晚期妊娠胎盘绒毛膜癌细胞的JAR和BeWo b30亚克隆（b30）。通过评估Luc-LNP库在这些细胞系中的递送效率，发现不同细胞系中表现最佳的LNP配方有所不同，但含有C12和DOPE的配方（如LNP 5, 8, 10）在多种细胞中均表现出较高的递送效率。具体而言，在HTR8细胞中，LNP 8效果最佳；在JAR细胞中，LNP 5效果最佳；在b30细胞中，LNP 10效果最佳。相关性分析显示，HTR8和JAR细胞的递送数据高度相关，而b30细胞与其他两种细胞的相关性较低。将发光数据按脂质类型分组后发现，在HTR8和JAR细胞中，含有DOPE的LNP其发光倍数变化显著高于含有DSPC的LNP，表明DOPE作为磷脂成分有助于向这些细胞的递送。而在b30细胞中，基于脂质类型的发光倍数变化无统计学差异，但表现最佳的三个LNP（5, 8, 10）均含有C12和DOPE，提示这两种脂质对于向b30细胞的递送也至关重要。细胞活性实验表明，在测试剂量下，这些顶级LNP对细胞代谢活性影响较小，显示出良好的生物相容性。
缺氧培养改变滋养层细胞行为
研究比较了在低氧环境（1% O2，缺氧）和常氧环境（21% O2，常氧）下培养的滋养层细胞。缺氧培养显著增加了所有细胞系中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的累积表达。在PlGF分泌方面，缺氧降低了JAR和b30细胞在所有时间点的PlGF分泌，而对HTR8细胞的PlGF分泌没有显著影响，这与HTR8作为早期妊娠细胞系不产生高水平PlGF的特性一致。此外，缺氧还显著增加了三种滋养层细胞系的生长速率。这些结果表明，缺氧改变了滋养层细胞的活性，支持了在研究纳米颗粒药物递送时考虑这种病理生理变化的必要性。
缺氧增加LNP向滋养层细胞的递送
接下来，研究评估了缺氧对LNP介导的mRNA递送的影响。选用了在库筛选中表现优异的LNP 5, 8, 10，并封装了GFP mRNA（GFP-LNPs）。通过流式细胞术测量GFP平均荧光强度（MFI）发现，在所有细胞系中，24小时后的MFI均高于2小时，表明更长的处理时间有利于mRNA的摄取和翻译。总体而言，GFP-LNP 5在所有细胞系和两种氧条件下均产生最高的MFI。缺氧培养对HTR8和JAR细胞的GFP-LNP递送没有显著影响，但显著增强了向b30细胞的递送，特别是在用GFP-LNP 5和8处理24小时后，缺氧培养的b30细胞MFI显著高于常氧培养。细胞代谢活性检测表明，这种递送增强并非由于LNP处理对细胞代谢的改变所引起。
缺氧抑制滋养层细胞合胞体化
为了创建更具生理相关性的培养系统，研究评估了缺氧对合胞体化的影响。合胞体化是指滋养层细胞融合形成胎盘功能外层屏障的过程。利用毛喉素（forskolin）诱导细胞融合，模拟合胞体滋养层的形成。通过免疫荧光染色检测紧密连接蛋白ZO-1的表达发现，毛喉素处理显著降低了b30细胞在常氧和缺氧下的ZO-1表达，表明细胞融合。在JAR细胞中，缺氧使细胞对毛喉素诱导的细胞融合更敏感。而在HTR8细胞中未检测到ZO-1表达，这与该细胞系缺乏融合能力的特性一致。进一步检测合胞体化标志物β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）和PlGF的分泌发现，在毛喉素处理的JAR和b30细胞中，缺氧条件下的β-hCG和PlGF分泌均显著低于常氧条件，表明缺氧抑制了毛喉素诱导的合胞体化标志物分泌。这凸显了在开发治疗方时考虑胎盘缺氧微环境的重要性。
合胞体化改变LNP与滋养层细胞的相互作用
研究进一步探讨了合胞体化如何影响LNP的递送。使用b30细胞，在缺氧或常氧下预培养48小时后，用毛喉素或DMSO处理48小时以诱导或抑制合胞体化，随后用GFP-LNP 5处理24小时。流式细胞术分析显示，在缺氧条件下经毛喉素处理的b30细胞（即合胞体化缺氧细胞）其GFP MFI显著高于其他实验组。通过荧光显微镜观察也发现，ZO-1表达较高的区域GFP表达可能较低。这表明毛喉素处理（诱导合胞体化）增加了LNP的递送，并且这种效应在缺氧培养下被进一步放大。
LNP介导的治疗性mRNA递送
为了验证研究结果在蛋白替代疗法中的相关性，将GFP mRNA替换为胎盘生长因子（PlGF）mRNA（PlGF-LNPs）。PlGF在胎盘中驱动血管生成，其在胎盘功能障碍相关疾病（如先兆子痫）中的表达水平降低。用PlGF-LNPs处理细胞后发现，所有处理组的PlGF分泌均高于相同条件下的PBS对照组。将PlGF分泌量按细胞数标准化后分析发现，合胞体化细胞（毛喉素处理）的PlGF分泌高于非合胞体化细胞（DMSO处理）。尽管缺氧降低了合胞体化细胞中PlGF-LNPs介导的PlGF分泌绝对值，但当计算LNP处理组相对于PBS对照组的PlGF分泌倍数变化时，发现缺氧条件下的倍数变化显著高于常氧条件，尤其是在毛喉素处理的细胞中。这表明PlGF-LNPs在缺氧条件下能更有效地增加PlGF分泌，并且LNPs能够将缺氧合胞体化细胞的PlGF水平恢复至常氧对照水平，为利用PlGF mRNA作为治疗分子干预胎盘缺氧相关疾病奠定了基础。
讨论
本研究首次系统评估了胎盘功能障碍关键微环境特征——缺氧，对纳米颗粒药物递送的影响。研究证明，缺氧通过增加HIF-1α表达、改变细胞生长和合胞体化进程，显著影响LNP与滋养层细胞的相互作用。尤为重要的是，研究发现缺氧与合胞体化相结合能增强LNP介导的mRNA递送和后续治疗性蛋白（如PlGF）的分泌。这提示在药物递送平台的临床前开发中，必须考虑疾病相关的微环境线索，以避免对胎盘和/或胎儿产生不必要的毒性，并提高治疗效率。研究的局限性包括使用了永生化或绒毛膜癌细胞系而非原代滋养层细胞，以及二维培养模型无法完全模拟复杂的胎盘结构。未来的研究将转向包含原代细胞和更复杂培养体系的模型。
结论
本研究阐明了缺氧微环境对LNP向不同孕期滋养层细胞递送mRNA的影响。研究证实缺氧能诱导疾病相关表型，并意外地增强LNP向缺氧合胞体化滋养层细胞的递送效率。成功利用LNPs递送PlGF mRNA至缺氧滋养层细胞并恢复其蛋白水平，为开发针对胎盘功能障碍的mRNA治疗策略奠定了基础。所建立的简单滋养层培养系统可用于研究胎盘功能障碍期间的细胞和分子信号通路，并为优化用于胎盘靶向治疗的LNP设计提供了框架，对解决母婴医学中未满足的关键需求具有重要意义。
