一种名为日本金龟虫(Popillia japonica)的入侵性害虫，正对欧洲的园艺作物和牧场构成严重威胁。这种起源于日本的害虫，自20世纪初传入美国后，已扩散至多个国家，并被欧盟列为优先防控的检疫性害虫。在葡萄牙的亚速尔群岛，日本金龟虫的防控尤为棘手。历史上，尽管尝试了诱捕、化学杀虫剂甚至引入外来的昆虫病原线虫和真菌(如Metarhizium anisopliae)等多种方法，但效果均不理想，虫害依然在群岛内蔓延。这凸显了寻找新的、更有效的生物防治策略的紧迫性。传统上，昆虫病原真菌(Entomopathogenic Fungi, EPF)如Beauveria bassiana和Metarhizium属真菌，被认为是很有潜力的生物防治剂。然而，其田间防治效果往往不稳定，这可能与菌株特异性、环境适应性以及与本地微生物组的复杂相互作用有关。近年来，有研究表明，本地的EPF菌株可能比商业化的菌株更具防控潜力，因为它们可能更好地适应了当地的环境条件。那么，在亚速尔群岛，是否存在特定的本地EPF，它们与日本金龟虫的种群密度是否存在关联？这些真菌能否成为抑制害虫种群的自然因子？为了回答这些问题，由Jorge Frias领衔的研究团队在《Biological Control》上发表了一项研究，他们利用高通量测序技术，对来自亚速尔群岛两个岛屿（São Jorge岛为高密度区，São Miguel岛为低密度区）的土壤和日本金龟虫幼虫样本中的真菌群落（即病原真菌组，pathomycobiome）进行了深入的比较分析。
研究人员主要运用了宏条形码(Metabarcoding)技术，针对真菌内部转录间隔区1(ITS1)区域进行高通量测序，以全面刻画土壤和幼虫肠道中的真菌群落结构和多样性。他们还利用生物信息学工具（如FUNGuild）对真菌按生态功能（如昆虫病原菌）进行了分类。同时，采用特异性PCR技术对关键EPF物种（如M. anisopliae, M. frigidum, B. bassiana）在个体幼虫中的发生率进行了验证。此外，研究还分析了土壤的理化性质（如有机质OM、pH、营养元素）和气候参数，并利用统计方法（如CCA）探究了环境因子与真菌群落结构的关系。
3.1. Amplicon ITS序列数据
通过对所有土壤和幼虫样本进行测序，共获得2,874,084条原始ITS reads。经过质控和去噪后，保留了1,958,510条高质量序列，用于后续分析。共鉴定出3499个真菌扩增子序列变异(ASVs)，其中近半数(44.87%)可注释到物种水平。
3.2. 土壤和昆虫的病原真菌组多样性和组成
α多样性分析显示，低密度(LD)站点的土壤病原真菌组Shannon指数显著高于高密度(HD)站点，表明LD站点土壤真菌群落具有更高的丰富度和均匀度。β多样性分析（NMDS）进一步证实，土壤病原真菌组在不同密度站点间的群落结构存在显著差异，而幼虫肠道病原真菌组的群落结构在不同密度站点间则无显著差异。韦恩图分析表明，幼虫肠道与它们所栖息的土壤共享了大量的真菌ASVs，说明土壤真菌群落对幼虫肠道菌群有重要塑造作用。
3.3. 土壤和昆虫肠道中最具代表性的分类群
在门水平上，LD站点土壤中优势菌门子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度显著高于HD站点。在科水平上，LD站点土壤中一些子囊菌门下的科（如Capnodiaceae, Bionectriaceae）更为富集。相比之下，幼虫肠道病原真菌组在门和科水平上，不同密度站点间未发现显著差异，优势菌门同样是子囊菌门。
3.4. 生态功能群和病原真菌生物标志物
通过FUNGuild功能预测分析发现，与HD站点相比，LD站点的土壤和幼虫样本中，包括昆虫病原菌在内的多个病原真菌功能群的丰度显著增加。对昆虫病原菌的进一步分析显示，在幼虫和土壤中最丰富的EPF物种包括M. anisopliae, M. frigidum, Cordyceps bassiana (即Beauveria bassiana)和Metacordyceps chlamydosporia。线性判别分析效应值(LEfSe)分析鉴定出多个在LD站点土壤中显著富集的EPF生物标志物，包括M. frigidum, Tolypocladium album, Lecanicillium primulinum等。值得注意的是，M. frigidum是唯一一个在LD站点的幼虫样本中也显著富集的分类单元。
3.5. EPF与土壤性质的相关性
典范对应分析(CCA)揭示了土壤和幼虫中的病原真菌群落结构与土壤理化性质之间存在显著关联。特别是，M. frigidum等LD站点的EPF生物标志物与土壤有机质(OM)、镁(Mg)、钙(Ca)、黏土和磷(P)含量呈正相关，表明这些土壤条件可能更有利于特定EPF的定殖和活动。
3.6. 幼虫样本中EPF丰度的验证
通过特异性PCR对个体幼虫中三种EPF（M. anisopliae, M. frigidum, B. bassiana）的发生率进行验证。结果显示，M. anisopliae在两个密度站点均有高发生率且无显著差异。而M. frigidum在LD站点幼虫中的发生率(32%)显著高于HD站点(13%)，这与宏条形码分析结果一致，进一步确认了M. frigidum作为LD种群生物标志物的地位。相反，B. bassiana在HD站点的发生率更高。
本研究首次系统地比较了亚速尔群岛不同日本金龟虫种群密度下的病原真菌组特征。研究结论指出，低密度日本金龟虫种群与更高多样性的土壤真菌群落相关，其中富含包括昆虫病原菌在内的多种病原真菌功能群。特别重要的是，研究鉴定出本地昆虫病原真菌M. frigidum作为一个关键的生物标志物，它与低密度虫群显著相关，并且其丰度与特定的土壤环境因子（如较高的有机质和黏土含量）密切相关。讨论部分强调，这一发现揭示了本地EPF在自然调控害虫种群中可能扮演着此前未被充分认识的角色。与之前引入的外来M. anisopliae菌株效果不佳形成对比，本地的M. frigidum等菌株可能因其对当地环境更好的适应性而具有更大的生物防治应用潜力。因此，后续研究应聚焦于分离这些本地EPF生物标志物，并评估其对日本金龟虫幼虫和成虫的致病力。同时，优化土壤管理以创造有利于有益EPF繁衍的环境，也可能成为增强生物防治效果的新策略。这项工作为开发基于本地微生物资源的、更具针对性和可持续性的日本金龟虫综合治理(IPM)方案提供了重要的科学依据和新的方向。
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