评估冻干番茄提取物对溶菌酶纤维化的抑制作用：光谱化学和显微分析

番茄提取物通过抑制溶菌酶淀粉样纤维形成发挥抗淀粉样作用，总多酚含量达278 mg GAE/100 g干重。光谱及原子力显微镜分析显示其可稳定蛋白质结构，减少疏水性变化，抑制率达78%（600 μg/ml）。

阿林达姆·达斯（Arindam Das）|舒克德布·辛格（Shukdeb Sing）|古兰加·贾纳（Gouranga Jana）|阿尼尔班·巴苏（Anirban Basu）

印度米德纳波尔维迪亚萨加尔大学（Vidyasagar University）化学与化学技术系，邮编721 102

摘要

本研究以鸡蛋白溶菌酶（hen egg white lysozyme）为模型蛋白，探讨了番茄提取物的抗淀粉样蛋白生成（anti-amyloidogenic）潜力。为了验证番茄提取物的生物活性，测定了其总多酚含量。通过多种光谱和显微方法评估了其抗淀粉样蛋白生成特性。硫黄素T（Thioflavin T）和刚果红（Congo Red）实验显示，溶菌酶的淀粉样纤维化过程受到剂量依赖性的抑制。此外，尼罗红（Nile Red）和8-氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid）实验表明，在番茄提取物存在下，蛋白质的疏水性变化较小。内在荧光测量结果也证实番茄提取物能够有效减少纤维化现象。原子力显微镜成像进一步证明番茄提取物显著抑制了溶菌酶的纤维化过程。

引言

在某些异常生理条件下，蛋白质和肽可能会失去其原有的功能结构，从而导致自我聚集[1]。这种聚集可能形成致病性的β-淀粉样纤维（pathogenic β-rich amyloid fibrils），这些纤维与阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病和2型糖尿病等多种神经退行性疾病有关[2,3]。不仅如此，这些致病性纤维在心脏、肾脏、肝脏等器官中的积累还会引发多种疾病，最终导致器官功能衰竭[4]。了解影响淀粉样蛋白形成的关键因素对于制定干预策略至关重要。 溶菌酶是一种常用的蛋白质模型，用于体外研究淀粉样蛋白形成过程。溶菌酶存在于脊椎动物和非脊椎动物的多个部位，具有天然的抗菌作用。关于溶菌酶参与淀粉样蛋白形成的机制已有大量研究，包括三级蛋白质结构的错误折叠及致病性纤维的生成[5]。 目前，已经有多种合成抑制剂（如多酚、生物碱、染料、纳米颗粒等）被用于防止蛋白质的错误折叠[6][7][8][9][10]。在当今注重健康的时代，天然膳食成分也因其保护作用而受到关注。其中，少数植物提取物被证实具有抗淀粉样蛋白生成活性，例如红甘蓝（Brassica oleracea var. capitata）、西兰花（Brassica oleracea var. italica）和绿茶（Camelia sinensis）。用于退烧的草药caesalpinia cristam的叶提取物对β-淀粉样蛋白（Aβ）纤维化具有显著的抑制作用[13]，crocus sativus花的柱头也具有很强的抗淀粉样蛋白生成能力[14]。 本研究重点关注番茄（Solanum lycopersicum）这种常见膳食成分在延缓淀粉样蛋白相关疾病中的作用。选择番茄是因为它在食物中的广泛应用以及其中含有的多种生物活性成分，如多酚、类胡萝卜素、维生素、糖苷生物碱和氨基酸等。这些成分具有抗增殖、抗癌、抗侵袭、抗炎和抗肿瘤作用[15]。番茄在预防和治疗阿尔茨海默病和帕金森病方面也表现出良好效果，且副作用较少[16,17]。本研究并未聚焦于具体的分子相互作用，而是选择番茄这一广泛使用的食物来应对日益增多的淀粉样蛋白相关疾病。

实验方法

化学试剂和缓冲液的制备

鸡蛋白溶菌酶（CEWL）及染色剂硫黄素T（ThT）、刚果红（CR）、尼罗红（NR）和8-氨基-1-萘磺酸（ANS）购自Sigma-Aldrich（美国）。Folin-Ciocalteu试剂（FC试剂）以及甘氨酸（Gly）、盐酸（HCl）、氯化钠（NaCl）和叠氮化钠（NaN3）等缓冲液成分购自Merck（德国）。甘氨酸-盐酸缓冲液是通过将甘氨酸溶解于适量双蒸水中制备的。

总多酚含量的测定

对番茄水提取物进行植物化学分析后发现其中含有丰富的多酚化合物。总多酚含量（TPC）采用Folin-Ciocalteu方法测定，结果以每克提取物中的没食子酸当量（GAE）表示。校准曲线基于标准没食子酸得出，公式为 y = 0.007× + 0.177，R2 = 0.99。测得番茄水提取物的总多酚含量为278 mg GAE/100 g干重。

光谱分析

使用UV-Vis和FT-IR等技术对番茄提取物进行了表征。

结论

本研究表明，番茄提取物（TOM）在体外具有抑制溶菌酶纤维化的作用。实验结果显示，TOM的抑制效果与浓度呈正相关，且具有S形生长动力学。在600 μg/ml浓度下，TOM可抑制近78%的纤维化现象。尼罗红（NR）、8-氨基-1-萘磺酸（ANS）实验及内在荧光测量均证实TOM显著降低了溶菌酶纤维化的表面疏水性、氨基酸残基的微环境变化以及三级结构的变化。

作者贡献声明

阿林达姆·达斯（Arindam Das）： 负责初稿撰写、方法设计、实验实施、数据分析及概念框架构建。 舒克德布·辛格（Shukdeb Sing）： 参与实验实施及数据分析。 古兰加·贾纳（Gouranga Jana）： 参与实验实施及数据分析。 阿尼尔班·巴苏（Anirban Basu）： 负责初稿撰写、结果验证、实验监督、资金筹集、数据分析及概念框架构建。

利益冲突声明

作者们声明没有利益冲突。

致谢

作者SS获得了印度高等教育委员会（UGC）的青年研究奖学金。同时感谢维迪亚萨加尔大学（Vidyasagar University）提供的实验设备支持。